تماس با ما

فید خبر خوان

نقشه سایت

فروشگاه فایل های دیجیتالی کمیاب

فروشگاه فایل های دیجیتالی کمیاب


اگر به یک وب سایت یا فروشگاه رایگان با فضای نامحدود و امکانات فراوان نیاز دارید بی درنگ دکمه زیر را کلیک نمایید.

ایجاد وب سایت یا
فروشگاه حرفه ای رایگان

دسته بندی سایت

محبوب ترین ها

پرفروش ترین ها

پر فروش ترین های فورکیا


پر بازدید ترین های فورکیا

برچسب های مهم

پیوند ها

اشتراک در خبرنامه

جهت عضویت در خبرنامه لطفا ایمیل خود را ثبت نمائید

Captcha

آمار بازدید

  • بازدید امروز : 8301
  • بازدید دیروز : 12575
  • بازدید کل : 1335191

تولید نوروسفر از سلول هاي بنیادی مزانشیمی مغز استخوان


تولید نوروسفر از سلول هاي بنیادی مزانشیمی مغز استخوان

چکیده

هدف :هدف ما در این پژوهش پاسخ به این سوال است که آیا MSCs بعد از کشت طولانی مدت می­توانند به طورخود­بخودی به سلول­های پیش­ساز عصبی تمایز یابند.مواد وروش­ها: این تحقیق شامل دو گروه می­باشد: کشت پاساژ پنجم MSCs در محیط کشت -MEMαو FBS%10 به مدت سه هفته بدون تعویض محیط یا استفاده از القاگر به عنوان گروه آزمایشی و پاساژ پنجمMSCsبدون کشت طولانی مدت به عنوان گروه کنترل. سپس هر گروه توسط واکنش زنجیره­­ای پلیمراز(RT- PCR) به منظور بیان ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک ( NGF، BDNF، NT3، NT4/5و GDNF) و ژن­های نورونی (Nestin،TH وNurr1) ارزیابی شد. در این مطالعه، از ایمینوسیتوشیمی NestinوβІІІ-tubulinبه منظور تعیین سلول­هایی که این نشانگر­ها را بیان می­کنند استفاده شد.نتایج: پاساژ پنجم MSCsکه از موش صحرایی بالغ استخراج شدند،بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) قادرند بطور خودبخودی به سلول­های شبه نوروسفری تمایز یابند و به نشانگر نستین پاسخ مثبت می­دهند. بعد از هفته دوم کشت، سلول­های شبه نورونی به نشانگر βІІІ-tubulinواکنش مثبت نشان دادند.بررسی­های آماری نشان داده است که MSCsدر گروه آزمایشی افزایش معنی­داری از ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک NGFو GDNFو ژن­های نورونی NestinوNurr1را نسبت به گروه کنترل نشان دادند .(p<0.05)نتیجه گیری: در این مطالعه نشان داده شد که MSCsدر کشت طولانی مدت، به طورخودبخودی به نوروسفر تمایز پیدا می­کنند بدون اینکه با فاکتور رشد یا القا­کننده خاص همراه شوند و قادرند ژن­های اختصاصی نورون­های دوپامینرژیک مانند THوNurr1را بیان کنند.مطالعات ما نشان می­دهد که MSCsدر شرایط کشت طولانی مدت توانایی تمایز به سلول­های نورونی را به طور خودبخودی دارا هستند و پیشنهاد می­شود منبع سلولی مناسبی در درمان بیماری­های نورولوژیکی باشند.

کلید واژگان: سلول­های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان،کشت طولانی مدت، تمایز خودبخودی، نوروسفر

فهرست مطالب

عنوانصفحه

فصل اول: مقدمه.. 1

مقدمهو مروری بر مطالعات گذشته.. 1

1-1 سلول­های بنیادی جنینی.. 3

1-2 سلول­های بنیادی بالغ.. 4

1-3 سلول­های بنیادی مغز استخوان.. 5

1-3-1مارکرهای سطحی خاص سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 8

1-3-2 تنظیم سیستم ایمنی توسط سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 8

1-3-3پتانسیل تمایزی سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 10

1-4 کاربرد درمانیسلول­های بنیادی مزانشیمی.. 14

1-5 انواع فاکتورهای رشد عصبی(NTFs) و ساختمان مولکولی گیرنده­های مربوط به آن­ها 17

1-5-1 فاکتورهای نوروتروفیک.. 17

1-5-1-1انواع فاکتور­های نوروتروفیک.. 18

1-5-2 گیرنده­های مربوط به فاکتورهای رشد عصبی.. 20

1-5-2-1 ساختار گیرنده P75NTRو اتصال نوروتروفین.. 20

1-5-2-2 ساختار گیرنده Trkو اتصال نوروتروفین.. 22

1-6 سلول­های بنیادی عصبی.. 25

1-6-1 نوروسفر.. 25

1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی.. 31

1-7 ضرورت اهداف تحقیق.. 33

فصل دوم: مواد و روش­ها.. 35

2-2 تهیه و نگهداری حیوان آزمایشگاهی.. 36

2-2 جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان موش صحرایی بالغ 36

2-2-1 طرز تهيه محیط کشت a-MEM.. 36

2-2-2 طرز تهيهPBS فاقد كلسيم و منيزيم (2/7 : PH).. 37

2-2-3 طرزتهيه تريپسين/ EDTA. 37

2-2-4 روش جداسازی و کشت سلول­های بنیادی مغز استخوان.. 39

2-2-5 پاساژ سلولی.. 39

2-3 تأييد هويت سلول‌هاي استرومايي به روش ايمونوسیتوشيمي.. 39

2-3-1 ايمونوسیتوشيمي CD71. 40

2-3-1-1 طرز تهيه پارافرمالدئيد 4%.. 41

2-3-1-2 طرز تهيه ژلاتين 1/0 درصد.. 41

2-3-1-3 ساخت سرم بز 10%.. 41

2-3-1-4طرز تهيهPBS ایمنوسیتوشیمی (4/7 – 2/7 = PH).. 42

2-3-1-5 طرز تهيه بافر گليسرول.. 42

2-3-2 رنگ آمیزی آلکالین فسفاتاز.. 43

2-4بررسی مارکر عصبی βIII-tubulinدر سلول‌هاي مزانشیمی مغز استخوان به روش ايمونوسیتوشيمي.. 44

2-5 تایید هویت عصبی نوروسفر­ها به روش ايمونوسيتوشيمي.. 45

2-6 بررسي مولكولي بيان ژن­هاي اعضاي خانواده نوروتروفين.. 46

2-6-1 استخراج RNAكل از سلول‌هاي كشت شده.. 46

2-6-2بررسی کمی و کیفی RNAاستخراج شده.. 48

2-6-3 الكتروفورز ژل آگارز.. 49

2-6-4 واکنش ساخت cDNA(واکنش رونویسی معکوسRT-).. 52

2-6-5 انتخاب پرایمر.. 53

2-6-6 آماده‌سازي پرايمرها.. 54

2-6-7 واكنش PCR. 54

2-7 آنالیز آماری.. 58

فصل سوم: نتایج.. 59

3-1مشاهده مورفولوژی سلول‌هاي مزانشیمی مغز استخوان در شرایط کشت با میکروسکوپ اینورت.. 59

3-2 تعیین هویت سلول‌هاي مزانشیمی مغز استخوان با نشانگر CD71و آلکالین فسفاتاز 60

3-3 ویژگی­های مورفولوژیکی سلول‌هاي مزانشیمی مغز استخوان بعد از کشت طولانی مدت 60

3-4 تأييد هويت سلول‌هاي عصبي با استفاده از روش ايمونوسيتوشيمي.. 60

3-5 تأييد هويت نوروسفر­ها با استفاده از نشانگر نستین.. 61

3-6 ارزيابي بيان ژن­های فاكتورهاي نوروتروفيك و مارکرهای نورونی و بررسی آماری شدت باند­ها و نمودار­های مربوط به آن .. 61

4-1 نتیجه­گیری و بحث.. 70

4-1 مورفولوژی سلول­های بنیادی مزانشیمی در کشت طولانی مدت و تایید هویت آن­ها 71

4-2 بیان فاکتورهای رشد عصبی به وسیله سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 72

4-3 پتانسیل تمایز سلول­های بنیادی مغز استخوان به سلول­های عصبی 74

4-4 توليد نوروسفر از سلول­هاي بنيادي مغز استخواندر كشت طولاني مدت 76

4-5 نتيجه گيري.. 77

پیشنهادات.. 77

مراجع.. 79

فهرست شکل­ها

شکل 1-1. مسیرهای پیام رسانی که با واسطه P75NTRتنظیم می­شود.. 22

شکل 1-2.نوروتروفین­ها و گیرنده­های مربوط با آن:رسپتور تیروزین کیناز و P75NTR. 23

شکل 1-3. مسیرهای سیگنالینگ که با واسطه Trkتنظیم می­شود... 24

شکل 1-4. سلول­های بنیادی عصبی و رده­های سلولی مربوط به آن.... 25

شکل 1-5 .ارزیابی شکل­گیری نوروسفر.. 26

شكل 1.تصاوير فاز كنتراست سلول­هاي استرومايي مغز استخوان موش صحرايي در محيط كشت در پاساژهاي مختلف... 62

شكل 2.شناسايي سلول­هاي استرومايي مغز استخوان موش صحرايي.. 63

شکل 3. تصویر فاز کنتراست از MSCsدر پاساژ پنجم بعد از دو هفته .. 64

شکل 3. تصویر فاز کنتراست از پاساژ پنجم MSCsپس از هفته سوم.. 65

شکل4تأييد هويت سلول‌هاي عصبي با استفاده از روش ايمونوسيتوشيمي 66

شکل 5 تأييد هويت نوروسفر­ها با استفاده از نشانگر نستین .. 66

شكل6A.الگوی بيان ژن­ فاکتورهای نوروتروفیک در پاساژ پنجم سلول­های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) وB: گروهآزمایشی(کشت طولانی مدت)... 67

شكل 6. Cالگوی بيان ژن پیش­ساز عصبی و ژن­های اختصاصی سلول­های دوپامینرژیک در پاساژ پنجم سلول­های بنیادی مزانشیمی (گروه کنترل) و D. گروه آزمایشی (کشت طولانی مدت). 67

نمودار 6 A. مقايسه میزان بيان نسبی ژن­های فاکتور­های نوروتروفیک در گروه آزمایشی و کنترل.... 68

نمودار6 B.مقايسه میزان بيان نسبی ژن­های نورونی در گروه آزمایشی و کنترل.. 69

فهرست جدول­ها

جدول1-1 . اسامی گوناگون سلول­های بنیادی مزانشیمی.. 6

جدول1-2 اطلاعات مربوط به پرايمرها، F: پرايمر بالادست ، R: پرايمر پايين‌دست 57

فصل اول

مقدمه و مروری بر مطالعات گذشته

مقدمه

امروزه تحقیق بر روی سلول­های بنیادی به دانش پیشرفته­ای تبدیل شده است که نه تنها در حیات علمی، بلکه در بعد اقتصادی نیز موثر قلمداد می­شود ]1[. سال­هاست که این تفکر در ذهن دانشمندان شکل گرفته که با توجه به امکان تقسیم سلولی آیا می­توان درمان را بر پایه این سلول­ها بنا نهاد. این تفکر وتحقیق به تدریج به طرف طب جدیدی سوق داده می­شود که از آن به عنوانreparative (regenerative) medicineنام برده می­شود] 2[. پر واضح است برای رسیدن به این هدف، درک کامل بیولوژی سلولی و ماهیت سلول­های بنیادی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. خصوصا"علی­رغم تحقیقات وسیع، هنوز ابهامات متعددی پیرامون نحوه عملکرد سلول­های بنیادی وجود دارد ]3[.

سلول­های بنیادی، سلول­های زایای[1]غیر بالغ­اند که قادر به خود تکثیری (Self-renewal) هستند و از این طریق جمعیت سلولی خود را حفظ می­کنند]4[. هر سلول بنیادی در کنام یا نیچ[2] تنظیمی خود قرار گرفته است. کنام یک سلول، مجموعه­ای از عوامل فیزیکی و شیمیایی است که سلول را احاطه کرده است. از اعمال مهم کنام سلول­های بنیادی، تنظیم توازن بین خود نوزایی و تمایز است. یکی از مکانیسم­های تنظیم کننده این توازن کنترل تقسیم متقارن[3] و نامتقارن[4] می­باشد. در تقسیم نامتقارن، از تقسیم سلول ­بنیادی دو سلول دختری ایجاد می­گردد که یکی در کنام باقی مانده و دیگری کنام را ترک کرده تا تعداد زیادی پیش­ ساز ایجاد نماید و در نهایت به سلول­های بالغ تمایز پیدا می­کنند. در عوض در تقسیم متقارن، دو سلول­دختری ایجاد می­گردد که هر دو در کنام باقی مانده و به صورت بنیادی باقی می­مانند] 5،6[. بنابراین سلول­های بنیادی، سلول­های تمایز نیافته­ای می­باشند که توانایی خود تکثیری، تولید نسل تمایزیافته عملکردی و ترمیم بافت بعد از صدمه را دارا هستند ]7[.

سلول­های بنیادی بر اساس قابلیت تمایز به سه گروه تقسیم می­شوند:

همه توان[5]: جزء اولین سلول­هایی هستند که در جنین شکل می­گیرند(از تخمک لقاح یافته 1-3 روزه)، قابلیت تمایز به انواع سلول­های ارگانیسم را دارند] 4[.

پرتوان[6]: از توده سلولی داخلی[7] در مرحله بلاستوسیست 100تا 200 سلولی منشاء می­گیرند. اینسلول­ها دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند]7[.

چند توان[8]: اين گروه را سلول­هاي بنيادي بالغ[9] و يا سلول­هاي بنيادي سوماتيك نيز مي‌نامند که بصورت خاموش و غیر متعهد حفظ می­شوند تا در آینده و بر اساس نیاز فعال شده و به سایر دودمان­های مربوط به همان بافت تمایز یابند]8[، به عنوان مثال سلول­هاي بنيادي خونساز در مغز استخوان به تمام انواع سلول­هاي خوني مانند گلبول‌هاي قرمز، لنفوسيت‌هايBوT و ... تمايز مي‌يابند [9،10[.

سلول­های بنیادی از لحاظ منشاٴ به دو دسته­ی، سلول­های بنیادی جنینی (ESCs)[10]وسلول­های بنیادی بالغتقسیم می­شوند. از آنجا که استفاده از سلول­های بنیادی جنینی با مسائل اخلاقی و قانونی بسیار مواجه است و یا پیوند این سلول­ها خطر ایجاد بافت توموری را در پی خواهد داشت]7،11[، بنابراین کلید حل این مشکل به دست آوردن منبع عظیمی از سلو­ل­هاست به گونه­ای­که قابلیت تمایز بالاییداشته باشد و قادر باشند به دفعات نامحدودی در محیط کشت تکثیر شوند تا تعداد کافی سلول قابل دسترس برای پیوند و یا هر کاربرد درمانی و پژوهشی فراهم آورد]4[.

سلول­های بنیادی مزانشیمی از مهم­ترین سلول­های بنیادی بالغ است. این سلول­ها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein و Petrokova در سال 1966استخراج شدند ]12[. سلول­هايبنياديمزانشيميتوانتمايزبه چنديندودمانسلوليازجملهاستخوان،عصب،غضروفوكبدرا دارند] 13 .[این سلول­هابهعنوانيكمنبعايده­آلبراي سلولدرماني،ژندرمانيوبهعنوانابزاريبرايدرمانبيماري­هاي مادرزادی محسوب می­گردند] 14[. گزارش­هایی مبنی بر استفاده از اینسلول­هادرمدل­هايحيوانيبرايدرمانجراحاتنخاعي]15،16[،سكتةمغزي]17 [وپاركينسون] 18 [وجوددارد.

1-1 سلول­های بنیادی جنینی:

اولین تحقیقات در زمینه ESCsدر دهه 1960 شروع شد،هنگامیکهFinch و Ephrussii درسال1960 ، سلول­های سرطانی جنینی چند توان را از سلول­های زایای سرطانی تمایز نیافته انسان و موش جدا کردند]19.[

این سلول­ها اولين بار در سال1981 از توده سلولي داخلي جنين موش جدا سازی شدند، سپس درسال 1998، سلول­های بنیادی جنینی انساناستخراج شدند]20،10.[سلول­هاي بنياديجنينيفعاليتتلومرازيشديدي دارند و قادرند به طور نامحدودي تقسيم شوند، به گونه‌اي كه سلول­هاي بنيادي جنینی انساني را مي‌توان در شرايط محيط كشت تا بيش از يكسال به صورت تمايز نيافته حفظ كرد و جمعيت آنرا به 80 برابر رساند]10.[ حضور آلکالین فسفاتاز و تلومراز و بیان نشانگر اختصاصی SSEA-1 از ویژگی­های اختصاصی سلول­های بنیادی جنینی می­باشد] 21.[

این سلول­ها از توده سلولی داخلی بلاستوسیستجداسازی می­شوند که دارای توانایی تمایز و تکثیر نامحدود هستند و قادرند به هر سه لایه سلولی تمایز یابند، این ویژگی را Pluripotent می­نامند. محققین اولین باراین سلول­ها را از mice و اخیرا" از انسان و پریمات­ها جداسازی کرده­اند] 22، 23[. یک نکته مورد توجه در ارتباط با سلول­های بنیادی جنینی موش این است که این سلول­ها پس از آنکه در محیط کشت و شرایط آزمایشگاهی قرار می­گیرند، تکثیر شده و بعد از پیوند به جنین­ در مرحله قبل از کاشته شدن، ویژگی پلوری­پوتنتی خود را حفظ کرده و قادرند انواع بافت­های تمایز نیافته با منشا اکتودرمال، مزودرمال و اندودرمال را تولید کنند ]7، 24[ مشابه همین ویژگی­ها در سلول­های بنیادی جنینی انسان نیز دیده شده است ]7[.بنابراین گرچه سلول­های بنیادی جنینی از قدرت تكثير و تمايز بالايي برخوردارند اما كاربرد این سلول­ها با موانع اخلاقی و قانونی همراه بوده و پاسخ ايمني را در فرد گيرنده افزايش مي‌دهند [7،11،10]. علاوه بر آن وقتی سلو­ل­های بنیادی جنینی انسان یا موش به حیوانات متولد شده پیوند زده می­شودند تولید تومور می­کنند که حاوی انواع متفاوتی از بافت­ها شامل: پوست، مو و عضله می­باشد که تراتوما نامیده می­شود]25[، حضور سلول­هایی از سه لایه جنینی در این تومور، نشان دهنده ظرفیت تمایزی بالای این سلول­هاست بنابراین استفاده درمانی از این سلول­ها با مشکلاتی همراه است]7[.

1-1 سلول­های بنیادی بالغ

سلول­های بنیادی بالغ،سلول­های سوماتیکی هستند که در بافت بالغ حضور دارند و قادرند به سلول­های بنیادی بالغ،سلول­های سوماتیکی هستند که در بافت بالغ حضور دارند و قادرند به سلول­های بافتی که از آن منشا می­گیرند، تمایز یابند. اين سلول­ها را مي‌توان در بافت­هايي مثل استخوان تيغه‌اي (ترابكولار)، بافت چربي، مغز، سينوويوم، عضله اسكلتي، ريه، طحال، كبد، كليه، مغز استخوان، غضروف، قلب، پوست، دندان­هاي شيري و سلول­هاي اطراف عروق مربوط به ژله‌ وارتون بند ناف انسان نيز مشاهده نمود [14،26]. یکی از نکات مهم در مورد سلول­های بنیادی بالغ این است که تعداد آن­ها در هر بافتی محدود است. این سلول­ها در حالت عادی در ناحیه خاصی از هر بافت به صورت خاموش به حالت تقسیم نشده وجود دارند و قادرند تحت شرايط فيزيولوژيك يا بدنبال ايجاد ضايعه، به سلول­هاي بافتي كه در آن قرار دارند تمايز يابند و بافت آسيب ديده را ترميم كنند و يا تحت شرايط خاصي نيز به به سلول­هاي ديگري كه مربوط به آن بافت خاص نمي‌باشد تمايز مي‌‌يابند، به اين ويژگي Trans-differentiationوياAdult­ stem cell plasticityمي‌گويند [3،27،28].

Ferrariو همکارانش در سال1998اولین بار differentiatioTrans- سلول­هایBMSCs را به سلول­های عضلانی و در همان سال Shiو همکارانش تولید سلول­های اندوتلیال از BMSCsراگزارش دادند]29،30[.Petersen تولید سلول­های کبدی از مغز استخوان را بعد از آسیب کبدی و Brazeltonو همکارانش در سال 2000 تولید نورون از BMSCs را گزارش دادند ]31،32 .[در سلول­های استخراج شده از بافت­های دیگر مانند عضله اسکلتی ]33 [و مغز ]34 [نیز این قابلیت تمایزی مشاهده شده است. امروزه فناوری سلول­های بنیادی و قابلیت تمایز آن­ها به انواع سلول­های بالغ و همچنین استفاده از آن­ها در درمان بیماری­ها به طور روز افزونی در حال پیشرفت بوده که امیدواری­هایی را در جهت ایجاد روش­های مبتنی بر سلول درمانی به عنوان یک جایگزین مناسب برای پیوند اندام کامل ایجاد نموده است.

1-3 سلول­های بنیادی مغز استخوان

سلول­های بنیادی مغز استخوان که در گروه سلول­های بنیادی بالغ قرار دارندشامل دو نوع

سلول بنیادی می­باشند: سلول­های بنیادی خون ساز [11](HSCs)و سلول­های بنیادی مزانشیمی MSCs[12] یاBMSCs) )]10،26 .[سلول­های بنیادی مزانشیمی از مهم­ترین سلول­های بنیادی بالغ هستند که به دلیل دارا بودن خاصیت خود تکثیری و توان تمایزی بالا، منبع مناسبی برای استفاده در برخی روش­های سلول درمانی و ژن درمانی می­باشند.

این سلول­ها اولین بار توسط مطالعات Friedenstein و Petrokova در سال1966شناسایی شدند. اینمحققین سلول­های پیش­­ساز تشکیل دهنده استخوان[13] را جداسازی کردند]12[. MSCsدارای ویژگی­هایی هستند که آن­ها را ازHSCs می­توان تشخیص داد، این سلول­ها قابلیت اتصال به ظروف کشت را دارند، از سلول­هاي خونساز مغز استخوان جدا می­شوند، به صورت سلول­های فیبروبلاست شکل، تکثیر یافته و تشکیل مجموعه­های کوچک سلولی متشکل از حدودا" 50سلول را می­دهند که به عنوان واحدهای تشکیل دهنده کلونی فیبروبلاستی ( [14](CFU-Fsتعریفمی­شود]35[.طی­ تحقیقاتی­که توسط OwenوFridensteine در سال 1998و Digirolamoدر سال 1999 انجام شد، نشان داده شد که کلونی­های CFU-Fاز نظر شکل ظاهری، اندازه و توانایی تمایز بسیار ناهمگن هستند. مجموعه­ی سلولی چسبنده خیلی سریع رشد کرده، وقتی به تراکم مناسب رسید، برای تکثیر بیشتر دوباره کشت داده می­­شود ]36،37[. این سلول­هاقادرند قدرت تکثیری خود را بیش از 40 برابر، حفظ می­کنند]4،38 [.

در مطالعات مختلف، سلول­های بنیادی مزانشیمی را با نام­های متفاوت به کار برده­اند که در جدول )1-1) آمده است ]14.[

جدول1-1 . اسامی گوناگون سلول­های بنیادی مزانشیمی

تعریف

نام

سلول­های چسبنده مغز استخوان شامل: سلول­هاي شبه فيبروبلاستي ، سلول­هاي اندوتليال و مونوسيت / ماكروفاژ‌ها می­باشد.

Precursor of non

-hematopoietic tissue

كلوني‌هاي ­سلول­هاي فيبروبلاستي و ندرتاً مونوسيت / ماكروفاژ

Colony forming unti-fibroblast (CFU-F)

 

سلول­هايي كه قادرند به كف ظرف كشت بچسبند

Mesenchymal stem cells (MSCs)

سلول­هايي از مغز استخوان كه قدرت چسبندگي داشته و يا سلول­هاي شبه فيبروبلاستي،سلول­هاي اندوتليال و كلوني‌هاي متشکل از

مونوسيت / ماكروفاژ

Marrow stromal cells

سلول­هاي غير خونساز (Non-hematopoietic)با منشاء مزانشيمي که از نظر ریخت شناسی شبیه سلول­های فیبروبلاست می­باشند.

-Bone marrow stromal (stem) cells (BMSSCs) and / or -Stromal precursors cells(SPCs)

RS-1سلول­هاي دوكي شكل

RS-2سلول­هاي دوكي شكل و حد واسط

mMSCsسلول­هاي دوكي شكل و پهن

RS-1,RS-2,­mMSCs­ (RS:Recycling stem cell) (m: mature) [39]

سلول­هاي پيش ساز مشتق از مغز استخوان كشت داده شده

Multipotent adult progenitor cells (MAPCs)

   

علاوه بر موارد بالا، جمعیت سلولی به همراه سلول­های بنیادی مزانشیمی از مغز استخوان جدا می­شوند این سلول­ها را اصطلاحاًسلول­های زاینده چند ظرفیتی بالغ [15](MAPC)می­نامند و در محیط کشت به رده سلول­هاي نورواكتودرمي و اندودرمي تمايز مي‌يابند [41،40،4]. اخیراً حضور MSCsدر بافت­های دیگری به غیر از مغز استخوان اثبات شده است که شامل: پری استئوم،استخوان ترابکولار، بافت چربی، سینوویوم، عضله اسکلتی، پالپ دندان، بافت زیرجلدی پوست پس سر، لیگامان دور دندان، خون مایع آمنیوتیک، تیموس، طحال موش و انسان بالغ می­باشد ]4، 26 .[

تاکنون دو نوع سلول بنیادی از بافت چربی استخراج شده است که با نام­های مختلفی به کار برده می­شوند که شامل ] [16]PLA10،42 [و سلول­های بنیادی بالغی که از بافت چربی جداسازی می­شوند[17](ADAS)]10،43[. این سلول­ها از توانایی تمایزی یکسانی برخوردارند. بنابر­این پیشنهاد شدهاست که یک سیستم مزانشیمیدر همه بافت­های بالغحضور دارد. بطورتجربی MSCsکه از بافت چربی و بند ناف استخراج می­شوند مشابه BMSCs، برای استفاده در درمان مورد توجه قرار گرفته­اند، البته در مواردی با BMSCsتفاوت دارند که می­توان به این­ صورت ذکر کرد: قدرت تکثیر در سلول­های مزانشیمی که از بافت چربی منشا می­گیرند بالا بوده ولی قدرت تکثیردر سلول­های مزانشیمی­که از بند ناف منشا می­گیرند بسیار پایین­تر است. در سلول­های مزانشیمیکه از بافت چربی استخراج شده مارکر سطحی CD106 و در سلول­های مزانشیمی بند ناف مارکر سطحیCD90وCD105 بیان می­شود و قدرت تمایز و بیان ژن در سلول­های مزانشیمی بند ناف کمتر است ]4،44، 45 .[

MSCs، 1/0-001/0 درصد از جمعیت سلول­های هسته دار مغز استخوان را تشکیل می­دهند ]10،11 .[این سلول­ها از توانایی ازدیاد و تکثیر بالایی در شرایط آزمایشگاهیبرخوردار هستند و به رده­های سلولی متعددی تمایز می­یابند]4.[MSCsهمچنین ژن­هایی با منشاٴ جنینی، مولکول­های شرکت کننده در اتصالات بین سلولی، پروتئین­های ماتریکس خارج سلولی مثل کلاژن تیپ 1و فیبرونکتین را بیان می­کنند. علاوه برآن، سایتوکین­هایی مانند اینتر ­لوکین 8، 11، فاکتور­های[18]SCFوSDF-1[19] را ترشح و بیان می­کنند ]4،11،46[. در واقع سلول­های بنیادی مزانشیمی موجود در مغز استخوان یک نیچ یا کنامتنظیمی برای سلول­های بنیادی

خون ساز ایجاد می­کنند]14،47[.در اين محيط سيتوكين‌هاي آزادشده و میان کنش­های بين

سلولي، نقش مهمي را در تكثير و تمايز پيش سازهاي خوني ايفا مي‌كنند [48].

 

1-3-1مارکر­های سطحی خاص سلول­های بنیادی مزانشیمی

تلاش­های چشمگیری برای شناسایی مارکر سلولی خاص برای سلول­های MSCsانجام شده

است اما نشانگر اختصاصی این سلول­ها هنوز شناخته نشده است. MSCsممکن است توسط عدم بیان مارکرهای هماتوپویتیک مانند CD14، CD45، CD34و عدم بیان مارکر اندوتلیالی (CD31/PECAM-1)وبیان ترکیبی از مولکول­های سطحی مانند SH2) CD105یا(endoglin CD73 (SH3-SH4)، CD106 (VCAM-1)، CD44 (گیرنده اسید هیالورونیک)، CD90

(Thy1.1)، CD29، STRO-1،CD54 (ICAM-1)،CD94 ،CD13 ،CD47 ،CD164 ] 51[

] CD7149،50[،مارکر­های فیبرونکتین] 51[و آلکالین فسفاتاز ]48[ شناسایی می­شوند. بسیاری از مارکر­های مولکولی دیگر مانند: مولکول­های چسبنده، کموکاین­ها، گیرنده­های سایتوکین مانند گیرنده فاکتور رشد اپیدرمیEGFR[20])یا ] (HER-14،52[و مولکول­های درگیر در پاسخ ایمنی (MHC class I and II, CD119/interferon-g-receptor)توسطMSCs بیان می­شوند]4،53.[

1-3-2 تنظیم سیستم ایمنی توسط سلول­های بنیادی مزانشیمی

سلول­های بنیادی مزانشیمیدارای ویژگی تنظیم کنندگی سیستم ایمنی می باشند. یکی از خصوصیات مورد توجه MSCs گریز این سلول­ها از شناسایی و مهار پاسخ ایمنی استکه این امر به دلیل خواص فنوتیپی و عملکردی آن­ها می­باشد]54[.خصوصیت مهاری MSCs، انواعی از عوامل سیستم ایمنی شامل TcellهایCD+4،CD+8 ]4،55،56[،]Bcell 53،57[، سلول­های کشنده طبیعی (NK cell)1 ]4،58 [و سلول­های دندریتیک تمایز یافته مونوسیت­ها] 4،59[را سرکوب می­کنند.

MSCs ممکناست واکنشایمنی را در شرایط in vitro و in vivo با یک روش مستقلاز MHC[21]مهارکنند] 4،53،60[. اگر چه در حال حاضر مکانیسم­های دقیق سرکوب سیستم ایمنی به واسطه MSCsکاملا مشخص نیست اما در مجموع، عوامل متعددی که در تنظیم سیستم ایمنیو مهار ازدیاد سلول­های Tتوسط MSCsاستفاده می­شود شامل ترشح فاکتور­های رشد ( اثر غیرمستقیم) و ارتباط سلول با سلول (اثر مستقیم) می­باشد] 4،53،60[. تنظیم سیستم ایمنی نه­تنها توسطMSCs ، بلکه توسط سلول­های تمایز یافته مثل فیبروبلاست، ادیپوسیت و استئوبلاست نیز گزارش شده است ]4[. در مدل موش این سلول­ها می­توانند پاسخ ایمنی اختصاصی به آنتی­ژن که با واسطه سلول­های Tخاطره و عادی ایجاد می­شود را مهار کنند که این مسیر به طورقطعی هم راستا با اتصال سلول با سلول است ]4،61[ بر خلاف مدل موش، در انسان اثرات مهاری سیستم ایمنی توسط MSCs، در غیاب ارتباط سلول به سلول و با واسطه ترشح فاکتور­های محلول می­باشد] 4 ،53،60[. در بین فاکتور­های محلول، فاکتور[22]β1–TGFو فاکتور­رشد هپاتوسیتی[23] ]4،62[، پروستاگلاندینE2،فاکتور رشد اندوتلیوم وسکولار[24] ]59،63[، ایندول آمین 2و3 دی اکسیژناز (IDO)] 53،56[،از عوامل شرکت کننده در فعالیت سرکوب ایمنی توسط MSCsانسانی می­باشند .در این سلول­ها آنتی ژن­های MHCکلاس 1 به مقدار کم بیان می­شوند ولی آنتی­ژن­هایMHC کلاس 2 بیان نمی­شوند. عدم بیان مولکول­های MHCکلاس2 این امکان را به وجود می­آورد که MSCsاز شناسایی سلول­های T فرار کنند]54[. نحوه بیان آنتی ژن­هایMHC کلاس1 توسط سلول­های مزانشیمی بسیار مهم است زیرا بیان این مولکول­ ها در سلول­های بنیادی مزانشیمی باعث محافظت آن­ها در مقابل سلول­های کشنده طبیعی خواهد شد. عملکرد اصلی سلول­های کشنده طبیعی از بین بردن سلول­های توموری است که مولکول­هایMHC بر سطح آن­ها کاهش یافته است] 64[.MSCs علاوه بر عدم بیان مولکول­های MHCکلاس 2، مولکول های کمک تحریکی از جمله CD80 (B7.1)CD86 (B7.2)و CD40Lرا نیز بیان نمی­کنند این مولکول­ها برای القا پاسخ سلول­های T عملکردی لازم هستند]54[.

MSCsتحت تاثیر عوامل ریز محیطی قرار می­گیرند و به بعضی از سایتوکین­های التهابی از جمله IL-1β]65[،]IL17 66 [و از همه مهمتر ایتنرفرون گاما (IFN-γ) پاسخ داده و عملکرد آن­ها به طور چشمگیری تحت تاثیر قرار می­گیرد.IFN-γ در بعضی از شرایط فعالیت سرکوب ایمنی سلول بنیادی مزانشیمی را افزایش می­دهد] 53[.

سلول­هایNK ، از عوامل اصلی ایمنی ذاتی هستند که در حذف سلول­های بدخیم و آلوده به ویروس نقش کلیدی دارند ]67[. سلول­هایT،B و پیش سازهای سلو­ل­های کشنده طبیعی از مغز استخوان منشا می­گیرند که در آنجا با سلول­های بنیادی مزانشیمی بر هم کنش نزدیکی دارند. نتایج چندین مطالعه بیانگر این مطلب است که تکثیر سلول­های کشنده طبیعی در حضور IL2وIL15، توسطMSCs مهار می­گردد ]68.[همچنینMSCs سبب القا ترشح سایتوکین­هایی همچون IFN-γوTNF-α بوسیله سلول­هایNK می­شوند.اثرMSCs بر تولید سایتوکین­ها توسط سلول­هایNKطی مطالعاتی بررسی شد. Sotiropoulou و همکارانش در سال2006 گزارش دادند که سلول­های کشنده طبیعی فعال شده باIL2 ، بعد از کشت با سلول­های بنیادی مزانشیمی، مقادیر خیلی کمی از سایتوکین­های القا کننده IL15(IFN-γو به مقادیر کمترIL10و (TNF-α را تولید می­کنند]68[، Spaggiariو همکاران نشان دادند که سلول­های کشنده طبیعی فعال شده با IL2، بعد از مجاورت کوتاه مدتباسلول­های بنیادی مزانشیمی IFN-γرا تولید می­نمایند] 58[. در مطالعه­ای Poggiو همکارانش نشان داده شد که سلول­های کشنده طبیعی تازه جدا شده، بعد از مجاورت با سلول بنیادی مزانشیمی، TNF-αو IFN-γراترشح می­کنند،واکنش متقابل بین گیرنده ICAM-1 روی MSCsوگیرنده LFA-1روی سلول­های NKبرای تولید سایتوکین­ها ضروری است ]58، 69[.­

طیمطالعاتی به خوبی مشخص شده است­کهIFN-γ نقش مهمی­در پیشبرد فعالیت سرکوبگری MSCs­دارد] 70[.همسو با این مشاهدات، Kramperaو همکارانش نشان دادندکه با اضافه کردن آنتی بادی علیه گیرنده IFN-γ در محیط کشت، از مهار پاسخ ایمنی توسط MSCsبر روی سلول­هایTCD4+،TCD8+و حتی سلول­های کشنده طبیعی ممانعت به عمل می­آید] 53[.

از آنجائیکه MSCsعملکرد سلول­های T خاطره­ای، سلول­های Bو سلول­های کشنده طبیعی و همچنین تمایز و عملکرد سلول­های دندریتیک مشتق شده از مونوسیت­ها را سرکوب می­کنند، پس میتوان گفت که سلول­های بنیادی مزانشیمی تقریباً تمام سلول­های شرکت کننده در پاسخ ایمنی را مهار می­کنند و به دلیل گریز این سلول­ها از شناسایی و پاسخ ایمنی ضعیف، در روند درمان و پیوند حائز اهمیت می باشند] 71 .[

1-3-3 پتانسیل تمایزی سلول­های بنیادی مزانشیمی

سلول­های بنیادی مزانشیمی، سلول­های چند توان multipotent)) هستند که توانایی تمایز بهرده سلول­های مزانشیمی مانند استئوسیت، کندروسیت و ادیپوسیت [12، 13] را دارا هستند. علاوه بر این سلول­های مزانشیمی تحت شرایط آزمایشگاهی قادرند به رده سلول­های غیر مزانشیمیاز جمله عضله اسكلتي [29]، عضله قلبي [72]، هپاتوسيت‌ها [31] حتی نورون و گلیا نیز تمایز یابند، این ویژگی سلول­های مزانشیمی را Transdifferentiation می­نامند.MSCsدر محیط کشت حاوی β-گلیسرول فسفات ، اسید آسکوربیک 2- فسفات، دگزامتازون و سرم جنین گاو به استئوبلاست تمایز پیدا می­کنند، همچنین در شرایط کشت سه بعدی، محیط فاقد سرم و وجود یکی از اعضای خانواده TGF-β، به سلول­ های کندروژنیک تمایز می­یابند. در این شرایط سلول­ها به سرعت مورفولوژی فیبروبلاستی خود را از دست می­دهند و شروع به بیان ماتریکس خارج سلولی خاص سلول­های غضروف می­نمایند، که این حالت با بیوسنتز سریع گلیکوزآمینوگلیکانوتغییردر مورفولوژی سلول­ها همراه می­باشد]12[.MSCs برای تمایز به رده سلول­های چربی همراه با تولید واکوئل­های غنی از چربی، نیازمند حضور ایزوبوتیل متیل گزانتین می­باشد[12]. Taylorو Jonesتمایز میوژنیک سلول­های جنینی و بالغ [73] و Wakitaniو همکارانش، تمایز میوژنیک سلول­های استرومایی موش صحرایی در حضور 5- آزا سیتیدین را گزارش دادند[74]. علاوه براین Phinneyو همکارانش گزارش دادند که MSCsموشی که در معرض آمفوتریپسین Bقرار گرفته باشند فیبر­های چند هسته­ای میوتوب مانند، ایجاد می­کنند [75].

MSCsاستخراج شده ازموش صحرایی و انسانبا روش­های مختلف کشت به سلول­های شبه نورونیتمایز می­یابند. بنابراین استفاده از این سلول­ها امید بزرگی در درمان بیماری­های نورو­-

دژنراتیو می­باشد ]76، 77[.

در شرایط فیزیولوژیک،MSCs قابلیت تمایزی و خود تکثیری بالایی دارند. مطالعات نشان داده، که سلول­های بنیادی عصبی[25]((NSCs نیز بدلیل دارا بودن چنین ویژگی­هایی همواره مورد توجه محققان بوده­اند]78،79[،این سلول­ها نه تنها قادرند به سلول­هایی با منشا اکتودرمی تمایز یابند بلکه قادرند به سلول­های خونی نیز تمایز یابند] 32[. همین ویژگی در سلول­های بنیادی مزانشیمی نیز دیده شده است بطوریکه آن­ها به سلول­هایی با منشا غیر مزودرمی مانند سلول­های عصبی نیز تمایزمی­یابند. Tershikhو همکارانش در سال 2001 نشان دادند که یکسری فاکتور­های نسخه برداری توسط هر دو سلول­هایMSCs و NSCsبیان می­شود، از جمله ژن اریتروپویتین- فاکتور رشد خونساز و رسپتورش، در مغز انسان، میمون و موش بیانمی­شوند] 80[.ارتباط بین بیان ژن­های مختلف در این دو گروه، بدلیل ظرفیت تمایزی بالا و یکی از فاکتور­های مسئول پلاستیسیتی این سلول­ها می­باشدکه در هر دو مطالعات invitroوin vivo مشاهده شده است ]78[.

تاکنون روش­های متعددی مبنی بر تمایز MSCs به نورون گزارش شده است که شامل:

- القاگر شیمیایی

- سایتوکین­ها

- هم کشتی[26] با سلول­های عصبی

- القاگر شیمیایی به همراه سیتوکین­ها

- سیتوکین­ها به همراه انتقال ژنی] 81، 82[.

تیمارMSCs باisobutylmethylxanthine و AMPDibutyrylcyclic که از عوامل افزایش دهنده cAMPدرون سلولي می­باشند، موجب تمايز این سلول­ها به سلول عصبي مي‌گردد ]83.[Woodburyدر سال 2000 سلول­هاي بنيادي مزانشيمي انسان و موش صحرايي را در محيط كشت تا بيش از 20 پاساژ پيش برد و سپس سلول­ها را در معرض محيط كشت فاقد سرم‌ و حاوي بتامركاپتواتانول (BME) یا دی­متیل سولفوکسید و butylatedhydroxyanisol قرار داد، این سلول­ها فنوتيپ سلول عصبي را نشان دادند و بدين ترتيب حدود 80% از سلول­های کشت شدهNSE[27]وNF-M[28]را بیان کردند]78،84.[

مطالعات Sanchez-Ramosو همكارانش نشان داد كه MSCs انسان داراي ظرفيت تمايز به سلولهاي عصبي می­باشند. در اين تحقيقات از اسيد رتينوئيك، فاكتور رشد اپیدرمی(EGF)[29] و BDNF[30]، جهتتمایز سلول­های استرومایی به سلول­های عصبی استفاده شد که به دنبال آن تعدادی از سلول­ها، ماركر عصبي NeuN[31](حدود 5%) و تعدادی ديگر ماركر آستروسيتي GFAP[32](حدود 1%) را دو هفته بعد از کشت بيان كردند]78[.متعاقبا هم­کشتیMSCs با سلول­های مزانسفالیک جنینی، تعداد سلول­های تمایز یافته را به حداقل دو برابر افزایش می­دهد]51،78 [.

MSCs وقتیبا­­ سایتوکین­های ­متفاوتی مثل EGFو bFGFهمراه می­شوند دچار تغییرات

دراماتیک شده، به سلول­های شبه عصبی تمایز می­یابند و مارکر­های خاصنورونی مثل نستین، نوروفیلامنت­ها، MAP-2[33]، βIII-tubulinوNeuNرا به میزان بالایی بیان می­کنند]4[. علاوه بر این،همکشتی MSCs و سلول­های بنیادی عصبی بالغ ((NSCو تزریق این سلول­ها به داخل مغز حیوان، منجر به بلوغ بیشتر این سلول­ها و تمایز آن­ها به سمت سلول­های نورونی و گلیالی بالغ می­شود] 4،85،86[. در تحقیقات اخیر گزارش شده است که، همکشتی ­MSCsبا سلول­های شوان، تمایز به نورون را در این سلول­ها القا می­کند ]87[. حتی MSCsکه در مراحل اولیهتمایز نورونی ­هستند(neural-primed MSC) برای تمایز نهایی­شان با آستروسیت]85،86[ یا سلول­های شوان هم­کشتی شدند ومورفولوژی نورونی یا آستروگلیالی بالغ را نشان دادند]4.[ هم­کشتی بین MSCs و NSCsجسم مخطط مغز میانی[34] جنین ، باعث تمایز NSCsبه سلول­های بیان کننده آنتی ژن­های عصبی Nestin، Tuj1و GFAPشده است[88].

Jiangو همکارانش در سال 2002 گزارش دادند که در اثر هم کشتی MAPCsبا آستروسیت­های اولیه، نورون­هایی ایجاد می­شوند که خصوصیات یک نورون کارا مانند تولید پتانسیل عمل و بیان کانال­های سدیمی را نشان می­دهند. این سلول­های MAPCsهمچنین قادرند تیروزین هیدروکسیلاز(TH)[35]، دوپامین و دوپا دکربوکسیلاز را همانند نورون­های دوپامینرژیکدر in vitroبیان کنند [89].

Jinو همکارانش در سال 2008 گزارش دادندکه هم­کشتی MSCsبا سلول­های پیش­ساز عصبیجنینی E13.5))بیان THرا در NSCsجنینی افزایش می­دهند.افزایشبیانTHبه علت ترشح فاکتور­های رشد عصبی مانند NGF[36]، BDNFاز MSCsمی­باشد[90]. مشابه به همین نتایجنیزدر هم­کشتی سلول PC12با MSCs مشاهده شده است [91].

Dezawaو همکارانش از روش ترانسفکت کردن MSCsباNICD[37] ( دمین داخل سلولی­گیرنده (notchبرای تمایز این سلول­هادر in vitroاستفاده کردند. notchیک پروتئین عرض غشایی بزرگ است که نقش وسیعی در تکامل دارد.MSCs ترانسفکت شده با NICD، با فاکتور­هایbFGF، فورسکولین و CNTF [38]تیمار شدند و بعد از پنج روز مورفولوژی شبه نورونی نشاندادند. این سلول­ها پس از تقسیم میتوز مارکر MAP2را بیان می­کنند. القا این سلول­ها با فاکتور GDNF[39]باعث تولید سلول­های TH مثبت و دوپامینرژیک می­شود [92].

1-4 کاربرد درمانیسلول­های بنیادی مزانشیمی

سلول درمانی، پیوند سلول­های بنیادی خود فرد یا شخص دیگری به صورت انتقال موضعی یا

تزریق سیستمیک را شامل می­شود. اساس سلول درمانی این است که سلول­های تمایز نیافته به محل آسیب دیده انتقال داده می شوند. این سلول­هاقادرند به ناحیه صدمه دیده مهاجرت کرده و تحت سیگنال­های موضعی به سلول­هایی با فنوتیپ مورد نظر تمایز یابند .این سلول­های تمایز یافته، برای ترمیم بافت آسیب دیده همکاری می کنند]12[. نتايج بررسي‌هاي گوناگون نشان داده است كه سلول‌هاي استرومايي مغز استخوان، سلول‌هاي مناسبي براي تمايز به سلول‌هاي عصبي بوده و داراي كارايي لازم براي انجام تحقيقات درماني خصوصاً در درمان بيماري‌هاي تخريبي سيستم عصبي از طريق روش‌هايي چون سلول ­درماني و ژن ­درماني می­باشند[4،14،78،93].

مزیت استفاده از MSCsدر برابر انواع دیگری از سلول­ها در سلول­ درمانی شامل در دسترس بودن، توانایی تکثیر، قابل پیوند بودن و توانایی تنظیم سیستم ایمنی بدون محدودیت اخلاقی است ]4[. توانایی تمایز سلول­های MSCsبه رده سلول­های عصبی درشرایط آزمایشگاهی و بعد پیونددر موش­های سوری و صحرایی، توسطSanchez-Ramos و همکارانش ارزیابی شد و نتیجه گرفتندکه ممکن است این سلول­ها در درمان بیماری پارکینسون، استروک و تراتوما نیز مناسب باشند]12،76[. علاوه بر این اخیراً توسط Mezy گزارش شده است که سلول­های بنیادی مغز استخوان انسان بالغبعد از پیوند، وارد مغز می­شوند و به نورون تمایز می­یابند]94[. مثال­های دیگری از استفاده درمانی MSCsگزارش شده است که شامل ترمیم عروق قلبی، درمان فیبروز ششی، صدمات نخاعی، ترمیم استخوان و غضروف می­باشد]12[.

MSCs وقتی به درون مغز جنینموش صحراییبه صورت داخل بطنی تزریق می­شودبه طور نرمال نمی­توانند از سد خونی- مغزی عبور کنند. این سلول­ها قادرند زنده بمانند، مهاجرت کنند و به سلول­های نوروگلیا تمایز پیدا کنند]4[. علاوه بر این بهبود کارایی همراه با پیوند این سلول­ها به ناحیه آسیب دیده در مدل حیوانی با بیماری پارکینسونی، آسیب­­­­های ایسکمی- هیپوکسی نورونی و صدمه شبکیه چشم نیز مشاهده شده است.] 95[.

سلول‌هاي MSCمي‌توانند به راحتي خود را با شرايط جديد سازش دهند به ‌طوري كه مي‌توان آنها را از شرايط in vitro به محيط in vivoمنتقل كرد و از قدرت مهاجرت بالايي برخوردارند [96].مهاجرت سلول‌ها به محل ضايعه بستگي به پاسخ سلول‌هاي التهابي دارد. بيان مولکول­ها ­چسبنده[40] و گيرنده‌هاي مربوط به آنها توسط سلول‌هاي التهابي مانند نوتروفيل‌ها و مونوسيت‌ها، باعث مي‌شود اين سلول‌ها بتوانند از سدخوني-مغزي گذشته و به سمت ضايعه هدايت شوند. بنابراين در هر ضايعه مغزي كه با پاسخ التهابي همراه است مانند پاركينسون و مالتيپل اسكلروز، براساس چنين مكانيسمي سلول‌هاي MSCبه سمت ضايعه مهاجرت مي‌كنند [97]. علاوه بر این، عوامل دیگری که در مهاجرت سلول­های بنیادی مزانشیمی نقش مهمی دارند SDF-1 و گیرنده آن CXCR4 می­باشد.طی آسیب، شیب غلظتی از سایتوکین­ها مانند SDF-1و HGF از بافت آسیب دیده ایجاد می­شود که بقا، تکثیر و مهاجرت سلول­های بنیادی مزانشیمی را افزایش می­دهند و باعث مهاجرت این سلول­ها به مناطق آسیب دیده می­شوند ]98،99،100[.

علاوه بر مزیت MSCsدر سلول درمانی،احتمال دوم در نقش درمانی این سلول­ها، تولید فاکتور­های رشد توسط این سلول­هاست. MSCsخود منبعی از فاکتور­های نوروتروفیک در بافت صدمه دیده است که ترمیم را تحریک می­کنند]78[. طی تحقیقات اخیر گزارش شده است که MSCsتوانایی تولید NGFوBDNFرادر شرایط کشت دارا هستند که با استفاده از تکنیک الایزا و RT-PCRوجود این فاکتور­ها در محیط کشت تایید شده است ]101-103.[کشت MSCsدر محیط DMEMمنجربه ترشح فاکتور­ها­ی نوروتروفیکBDNF،GDNF، NGFوNT3 می­شود ]78[.MSCs چندین ژن مربوط به فاکتور­های نوروتروفیک را بیان می­کنند که شامل: NGF، BDNF، CNTFوIGF-1[41]می­باشد و منجر به تحریک بقاء سلول­های نوروبلاستوما و نوروژنزیس در in vitroمی­شوند] 104، 105[. این نتایج نشان می­دهد که MSCsتوانایی تولید فاکتور­های نوروتروفیک و حفاظت از بافت آسیب دیدهرا در شرایط کشت استاندارد دارا هستند. به همین دلیل به نقش درمانی­شان در حفاظت از سیستم عصبی مرکزی[42] بیشتر تاکیدمی­شود]78[.

پیوندMSCs در ترمیم سیستم عصبی مرکزی اولین بار توسط Chenو همکارانش گزارش شد. طی این تحقیق،MSCs به همراه BDNFبه مدلی از انسداد شریان مغزی[43] موش صحرایی پیوند زده شد و مشاهده شد پیوند ترکیبی ازMSCs و BDNFبه مدل موش صحرایی بقا و تمایز MSCsرا افزایش داده و باعث بهبود کارایی می­شود. بنابراین پیوند MSCsبه همراهفاکتور­های نوروتروفیک می­تواند یک روش درمانی بسیار موثری در درمان بیماری­های نورولو ژیکیباشد]106،107[. طی تحقیقی دیگر، MSCsبالغ در حضور NGFو BDNFکشت داده شد. پس از تزریق این سلول­ها درون مغز موش صحراییبالغ باعث افزایش سلول­های پیوند زده شده در مجاورت ناحیه صدمه دیدهشدند و فانکشن حرکتیرا بهبود بخشیدند و تعدادی از این سلول­ها به مارکرهای نورونی وآستروسیتی پاسخ مثبت دادند. این گروه همچنین تاکید بر نقشفاکتورهای نوروتروفیک در بهبود مغز آسیب دیده موش صحرایی داشتند] 108،109[. تزریق MSCsبه مدل استروک پس از یک ماه منجر به اثرات مثبتی مانند کاهش ضخامت اسکار یا التهاب بافتی، افزایش تکثیر سلول­های درون­زا و سلول­های پیش­ساز الیگودندروسیت و افزایش بیانSCFو رسپتور مربوط به آن بر روی سلول­هایMSC در ناحیه مرزی ایسکمی می­شود. هم­چنین تزریق داخل شریانی کاروتید در این مدل بطور بارزی منجر به جوانه زدن عروق، بیان سیناپتوفیزین و افزایشتعداد سلول­های پیش ساز الیگودندروسیتی در جسم مخطط (corpuscallosum)و تولید دوباره آکسون-میلین گردید]109،110،111[.

MSCsهمچنینبه مدل موش صحرایی با آسیبنخاعی پیوند زده شد و توسط ردیابی با رنگ آمیزیایمنوفلورسانس GFPبررسی شد. با این روش مشخص شد این سلول­ها به محل صدمه مهاجرت کرده و بعد از پیوند، برخی از این سلول­ها مارکر نورونی و آستروسیتی را بیان می­کنند ]109،112[.

Chen و همکارانش MSCs انسان را در محیط کاندیشنال (شرطی)بافت آسیب دیده مغز کشت دادند و گزارش دادند که میزان فاکتور­های نوروتروفیک NGF، BDNF،HGFوVEGFدر محیطکشت افزایش می­یابد که با استفاده از تکنیک الایزا افزایش بیان این فاکتور­ها در تایید شده است] 78،113[. افزایش بیان NGFوBDNF در مغز آسیب دیده بعد از تجویز داخل عروقی سلول­های استرومایی در شرایط پاتولوژی در in vivo نیز مشاهده شده است ]114 .[محیط کشت یا بافت مصدوم،سلول­های استرومایی پیوند زده را با دو روش مختلف تحت تاثیر قرار می­دهد: با القا تولید فاکتور رشد یا تحریک تمایز سلول­های پیوند زده شده به سلول­های نورونی یا گلیالی]78[.بنابراين سلول­هاي استرومايي مغز استخوان در محل پيوند، علاوه بر آنكه قادرند تحت تأثير فاكتورهاي القايي از محيط تمايز يابند، خود اين سلول­ها نيز فاكتورهاي رشد را در محل پيوند آزاد كرده و بدين ترتيب نقش نوروپروتكتيو دارند [115].به‌دنبال ترشح اين فاكتورها قابليت مغز افزايش يافته و با مكانيسم‌هاي آنژيوژنز، نوروژنز و سيناپتوژنز و كاهش آپوپتوز، باعث ترميم بافت آسيب ديده و در نهايت بهبود کارائی بيمار خواهد شد [109].

1-5 انواع فاکتور­های رشد عصبی(NTFs)[44]و ساختمان مولکولی گیرنده­های مربوط به آن­ها

1-5-1 فاکتورهای نوروتروفیک

طی تحقیقات انجام شده، Cajalوهمکارانش بر این عقیده بودند که مهاجرتنوروبلاست­ها در طی تکامل سیستم عصبی در اثر تولید مواد شیمیایی است که توسط بافت هدف تولید می­شود این حالت را نوروتروپیسم یا کموتروپیسم نامیدند]116 .[بدنبال این فرضیات، Levi-Montalciniوهمکارانش ]117[ پی بردندکه روند تکوین سیستم عصبی جنین جوجه با ﺣﺬف جوانه اندام[45]­ تغییر پیدا کرده، بقا و اندازه نورون­های گانگلیون­ سمپاتیک توسط سوبسترای پلی­پپتیدی بنام فاکتور­ رشد عصبی NGFافزایش پیدا می­کند. این فاکتور در برخی تومور­های بدخیم، سم مار و غدد بزاقی شناسایی شد. این محققین ثابت کردند که مرگ نورونی در دوره تکوین جنینی پدیده­ای طبیعی است و طبق فرضیه فاکتور­های نوروتروفیک طی تکوین نورونی، میزان بقاء نورونی وابسته به این است که میزان کافی از فاکتورهای نوروتروفیک در دسترس نوروبلاست­ها باشد. نورو­ن­هایی که به میزان کافی این فاکتور­ها را دریافت نکنند از طریق آپوپتوز از بین می­روند ]116،118[.

فاکتور­های نوروتروفیک، خانواده­ای از فاکتور­های رشد پپتیدی هستند که در تکوین و بقاء سیستم عصبی مرکزی ضروری می­باشند. در طی دهه اخیر مشخص شدکه عملکردشان علاوه بر بقاء، شامل تنظیم رشد آکسونی و دندریتی، سیناپس، مهاجرت سلولی، تکثیر سلولی، پلاستیسیتی و بقاء نورون­های بالغ می­باشد] 119[.این مولکول­ها به طور معمول پروتئین­های کوچک و قابل حل با وزن مولکولی 13-24 کیلو­دالتون می­باشند و اغلب به صورت هومودایمر فعال می­شوند.یک نورون فاکتور­های نوروتروفیک را از روش­های مختلفی به دست می­آورد که می­توان به فاکتورهای نوروتروفیکمترشحه ازبافت هدف نورونی یا غیر نورونی، نورون­های مجاور به صورت پاراکرین یا به صورت اتوکرین توسط نورون اشاره نمود] 120.[

1-1-5-1 انواع فاکتور­های نوروتروفیک:

خانواده فاکتور­های رشد عصبی:

شاملNGF،BDNF،GDNF،NT3 وNT4/5 می­باشد. این خانواده به طور کلی نوروتروفین­ها نامیده می­شوند. حضور مداومی ار نوروتروفین­ها در تکوین سیستم عصبی مرکزی(CNS)جایی که شکل­گیری سیناپس و پلاستیسیتی وسیعی صورت می­گیرد مورد نیاز است. این فاکتور­ها قادرندبقاء، مورفولوژیو تمایز نورون­ها را حفظ کنند ]121.[

NGF اولین فاکتور نوروتروفیکی است که شناسایی شد.این فاکتور در سیستم عصبی محیطی[46]

(PNS) بر روینورون­های سمپاتیک عمل می­کند.در CNSبقاء وعملکرد نورون­های­کولینرژیک در بخش قاعده­ای مغز پیشین[47] که به هیپوکمپ عصب دهی می­کند را تحریک می­کند. این نورون­ها به شدت به NGF­کهتوسط بافت هدفشان یعنی نورون­های واقع در هیپوکمپ و نئوکورتکس،تولید می­شود حساس هستند که و اعتقاد بر این است که پروسه آلزایمر را تحت تاثیر قرار می­دهند]122،123[.

BDNFو NT3بطور گسترده­ایدر ساختار­های هیپوکمپ و قشری بیان می­شوند]123[، همچنین بقاء نورون­های حسی گانگلیون­ها را حمایت می­کنند]124[.NGF وBDNF بقاء و تمایز نورون­های­کولینرژیک رادر شرایط ­آزمایشگاهی تحریک می­کنند]116[. BDNFهمچنین بقاء نورون­های دوپامینرژیک در حال تکوین را در جسم سیاه[48] تحریک می­کند.بطور مثال ژن BDNFدر بسیاری از نواحی CNSبالغ مانند جسم مخطط بیان می­شود و بطور بارزی در شرایط سمیت با MPP+[49]در کشت نورون­های مزانسفالون جنینی کاهش پیدا می­کند] 116 ،125[.

نورون­های گانگلیونtrigeminalموش بهNGFوBDNFدر مراحلمختلفی از تکوین پاسخ می­دهند. برای مثال NGFوBDNF، رشد آکسونی را در نورون­های گانگلیون ریشه پشتی[50] (DRG) تحریک می­کنند] 123،126[.

NT3 دربقا و تمایز نورون های CNSوPNS نقش دارد و بعد از آسیب نخاعی، ترمیم آکسونیرا افزایش می­بخشد] 119[.طی تحقیقات دیده شده است کهنورون­های حرکتی نخاعی، ترمیم

آکسونیرا افزایش می­بخشدطی تحقیقات دیده شده است کهنورون­های حرکتی نخاع با ترشح اتوکرینNT3 و BDNF فعالیت خود را تنظیم می­کنند] 127.[

خانواده TGFβ:

اعضای مهم این خانواده شامل: GDNF ، نورتورین[51]، آرتمین[52]و پرسفین[53]می­باشند]118،119.[ GDNFاولین بار در سال 1993 به عنوان فاکتور رشدی که موجب بقا نورون­های دوپامینرژیک مغز میانی جنین می­شود، شناخته شدند. GDNFو لیگاندهای وابسته به آن موجب حفظ به موجب حفظ سلول­های عصبی دوپامینی مغز میانی و نورون­های حرکتی CNSمی­شود]128[. اهمیت GDNFبه دلیل کاربرد کلینیکی آن می­باشد که از نورون­ها در هر دو شرایط in vivoوin vitro در برابر توکسین های مختلفی در مدل­های حیوانی پارکینسونی محافظت می­کند.این فاکتور به عنوان یک واسطه درمانی موثر در بیماری­های نورون­های حرکتی مثل آمیولترال اسکلروزیس (ALS)] [54] 129[، پارکینسون]130[ و صدمات نخاعی] 131[کاربرد دارد.

خانواده Neuropoietin

از اعضای این خانواده می­توانLIF [55]، CNTF، IL-6 [56]،کاردیوتروفین -1 و Oncostatin- Mرانام برد]118،127 .[این خانواده ­عملکرد­های مختلفی بر روی سلول­های سیستم عصبی دارند ویژگی­های CNS مانند فنوتیپ نوروترنسمیتر، تمایز و تکوین نورونی و گلیالی و محافظت نورو­ن­ها از مرگ سلولی القا شده با آکسوتومی را در طی تکوین جنینی و در زمان بلوغ تنظیم می­کنند ]127،132[.

فاکتور رشد با منشا غیر نورونی:

از اعضای این خانواده می­توان فاکتور رشد فیبروبلاستی اسیدی (aFGF)و بازی (bFGF)

فاکتور رشد اپیدرمی (EGF)وفاکتور رشدشبه انسولینرا نام برد] 127[.

1-5-2 گیرنده­های مربوط به فاکتور­های رشد عصبی

نوروتروفین­ها، فاکتور­های رشد پلی­پپتیدی عضوی از خانواده NTFsهستند که از لحاظ ساختاری بسیار شبیه به هم هستند. نوروتروفین­ها بقا، تکثیر، تمایز و میلینه شدن نورون­ها را تحریک کرده، در رشد زوائد نورونی (آکسون و دندریت­ها) و ایجاد سیناپس نقش دارند و آپوپتوز را در نورون­ها کاهش می­دهند. این فاکتور­ها اثراتشان را از طریق اتصال به دو گیرنده مختلف، گیرنده تروپو میوزین کینازی (Trk) و گیرنده P75 NTR اعمال می­کنند. گیرنده P75متعلق به زیر خانواده فاکتور نکروز توموری می­باشد و اولین بار به عنوان گیرندهNGF شناساییشد.خانواده گیرنده­های Trkشامل TrkA(گیرنده(NGF،) TrkB گیرندهBDNF، NT4/5)،TrkC (گیرنده NT3) می­باشد. در برخی از موارد گزارش شده که NT3 به TrkAو TrkB نیز با تمایل اندکی متصل می­شود و همه نوروتروفین­ها با تمایل یکسانی به گیرنده P75 NTRمتصل می­شوند ]133[.

1-5-2-1 ساختارگیرنده P75NTR و اتصال نوروتروفین

P75NTRپروتئین داخل سلولی از خانواده رسپتور نکروز توموری [57](TNFR) است که تشکیل شده از بخش خارج سلولی غنی از سیستئین، یک بخش درون غشایی (عرض غشایی)و یک بخش داخل سیتوپلاسمی به نام دمین مرگ که روند آپوپتوز را در سلول­ها اعمال می­کند (شکل.1-1). P75NTRبر خلاف گیرنده TNFفاقد بخش کاتالیک در بخش سیتوپلاسمی می­باشد اما با پروتئین­های متعددی واکنش می­دهد و سیگنال­های مهم برای تمایز و بقاء نورونی را فعال می­کند.P75 به عنوان اولین رسپتور با تمایل بالا به NGFشناخته شد، اما بعدها متوجه شدند که این گیرنده با تمایل یکسانی به تمام نوروتروفین­ها متصل می­شود. عملکرد گیرنده P75پیچیده و متنوع است، زمانیکه با گیرنده تیروزین کینازی (Trk)به طور همزمان بیان شود در فانکشن­های بقاء، تمایز، افزایش رشد دندریت نقش داشته و باعث تکثیر و تمایز می­شود] 133[،به هر حالاین گیرنده ممکن است نقش مهمی در میلینه شدن داشته باشد]134[. مسیر پیام رسانی توسط P75NTR، منجر به تولید سرامید،NF-KB [58]و JNK[59]­ می­شود.این گیرندهدر شرایط مرگ سلولی، التهاب یا استرس در سیستم عصبی، به عنوان گیرنده مرگ سلولی عملمی­کند]122،135[. نوروتروفین ابتدا به صورت پیش­ساز پروتئینی به نام پرونورو­- تروفین ساخته می­شود سپس بریده شده و به نوروتروفین بالغ تبدیل می­شود. فعالیت بیولوژیک یک نوروتروفین با شکست پروتئولیتیک نوروتروفین آغاز می­شود و به شکل پرو- نوروتروفین مسیر آپوپتوزی را با واسطه P75NTR فعال می­کند و به شکل بالغ به رسپتور تیروزین کینازی متصل و بقاء سلولی را تحریک می­کند] 122،136[. طی تحقیقی بر روی سلول­های A875،اتصالNGF به صورت پرونوروتروفین (pro-NGF) و نوروتروفینبه گیرنده P75NTRمقایسهشد و مشاهده شد که پرونوروتروفین NGFحتی در غلظت­های کم، مرگ سلولی راآغاز می­کند] 133،137[. در مطالعات in vivo، pro-NGF از طریق گیرندهP75باعث مرگ سلول­های الیگودندروسیت در مدل آسیب نخاعی و آپوپتوزنورون­های قشری نخاعی در مدل آسیب مغزی می­شود]133[.

یکی از مسیر­های مهمی که توسطP75NTR فعال می­گردد مسیر JNKمی­باشد. فعال شدن JNKاز طریق میان کنش TRAF6[60]با P75NTRدر نهایت منجر به آپوپتوزسلول می­شود. علاوه بر TRAF6در فعال شدن مسیر JNK، چندین پروتئین دیگر نیز مانند NRIF[61] وNRAGE [62] با در بخش سیتوپلاسمی واکنش داده و مسیر مرگ سلولی را فعال می­کنند] 133[.

اتصال نوروتروفین به گیرنده P75NTR سبب فعال شدنNF-kBمی­شود که بقاء نورونی را با واسطه NF-kBتحریک می­کند.شروع این مسیر پیام رسانی، به چندین پروتئین شاملTRAF6، p62وRIP2[63]نیاز دارد. فعال شدن این مسیر در پاسخ به نوروتروفین سببانتقال NF-kBبههسته و شروع بیان Hes1/5شده و رشد دندریت را تنظیم می­کند]133[. یکی از نقش­های دیگر P75NTRتنظیم رشد اکسونی است. .RhoAعضوی از خانواده پروتئینی Rho می­باشد که سازماندهیاکتین اسکلت سلولی را در تیپ­های مختلف سلولی کنترلمی­کند.در غیاب نوروتروفین میان کنش بین P75NTRوRhoA، فعالیت RhoAرا حفظ کرده و رشد آکسونی را مهار می­کند. با اتصال نوروتروفین، RhoA از رسپتور جدا شده و باعث رشد­ آکسونیمی­شود] 133،138[.

­بنابراین نوروتروفین­های بالغ و نابالغ با اتصالبه P75NTRسه مسیر رافعالمی­کنند: بالغ و نابالغ با اتصالبه P75NTRسه مسیر رافعالمی­کنند: با فعال کردنNF-KB باعث بقای نورون و با فعال کردنJNKباعث مرگ نورونی می­شوند و با تنظیم پروتئین RhoA رشد آکسونی را کنترل می­کنند] 121[.

شکل 1-1. مسیر­های پیام رسانی که با واسطه P75NTRتنظیم می­شود. اتصال نوروتروفین نابالغ و بالغ به این رسپتورمسیر­های سیگنالینگ متفاوتی مانند بقا، آپوپتوز سلولی و رشد آکسون را تنظیم می­کند.

1-5-2-2 ساختار گیرنده Trk و اتصال نوروتروفین

رسپتور Trk از خانواده گیرنده­های تیروزین کینازی است که از یک بخش خارج سلولی دارای سه موتیف غنی از لوسین با دو زنجیره سیستئینی حاوی دو دمین C2- شبه ایمنوگلوبین (Ig-C2)، یک بخش عبور کننده از عرض غشا و یک ناحیه سیتوپلاسمی با بخش کینازی تشکیل شده است (شکل1-2). اتصال نوروتروفین­ها به گیرنده تیروزین کینازی بطور اساسی از طریق بخش Ig- C2 صورت می­­گیرد] 133،139[.

شکل 1-2.نوروتروفین­ها و گیرنده­های مربوط با آن: رسپتور تیروزین کیناز و .P75NTRنوروتروفین­ها به صورت دایمر و با تمایل یکسانی به گیرنده p75)متعلق به خانواده گیرنده نکروز توموری( و به طور اختصاصی به رسپتور تیروزین کیناز خاص خود متصل می­شوند. Trkرسپتور پروتیپیک تیروزین کینازی استکه با اتصال نوروتروفین دایمریزه شده و محل اتصال نوروتروفین به لیگاند را فعال می­کند.

با اتصال نوروتروفین به رسپتور تیروزین کیناز مسیر پیام رسانی[64] شروع می­شود و سبب اعمال متعددیمانند بقاء، تمایز، افزایش انشعابات دندریتی، شکل­گیری سیناپس، پلاستیسیتی، رشد آکسونی و جهت­یابی آکسونبهسمتنورون­های هدف می­شود]133[. اتصال نوروتروفین به این رسپتورمنجر به دایمری و فسفوریله شدن گیرنده می­شود، این وقایع بین همه­ی گیرنده­ها مشترک است. نوروتروفین­ها مسیر انتقال پیام مشترکی دارند. فسفریله کردن تیروزین یک بستری را برای فعال کردن پروتئین­های مسیرپیام رسانی فراهممی­کند (شکل.1-3). این پروتئین­ها سبب فعال کردن مسیر[65]ERK­­/[66]MAP kinase یا PI3-K[67]/AKT و PLCγ، در بخش سیتوپلاسمی می­شوند]119،133[.

کمپلکس نوروتورفین-رسپتور به داخل سلول وارد شده و در مسیر معکوس به جسم سلولی منتقل می­شود. در آنجا بر روی فاکتور­های نسخه برداری اثر می­ﮔﺬارد و منجر به بیان و سنتز ژن­ فاکتورهای نوروتروفیک، تمایز، بقا و پلاستیسیتی سیناپس می­شوند] 133[.

شکل 1-3. مسیر­های پیام رسانی با واسطه Trkتنظیم می­شود. اتصال نوروتروفین به گیرنده سبب فعال کردن پروتئین­های متعددی در بخش سیتوپلاسمی می­شود که با فسفریله کردن این پروتئین­ها همراه استاین اتصال مسیر­های پیام رسانی متعددی مانندRas، PI3KوPLCγ را فعال می­کندکه منجر به بقا، رشد دندریت، بیان ژن و پلاستیسیتی سیناپس می­شود.

توانایی این NTFsدر بقاء سیستم عصبی مرکزی و محیطی در طی تکامل و بعد از صدمه نورونی، منجر به این شد که این مولکول­ها به عنوان یک واسطه درمانی موثر برای درمان صدمات عصبی و بیماری­های نورودژنراتیو مورد توجه قرار گیرند. اکثر این ترکیبات اثرات فارماکولوژی را روی انواع خاصی­از نورون­ها اعمال می­کنند. بنابر­این به عنوان یک واسطه درمانی مناسبی برای درمان بیماری­های نورودژنراتیو انتخاب شدند. برای مثال در انسان برای درمان بیماری­های نورولوژیکی مختلفی مانند آمیولترال اسکلروزیس از CNTF و BDNF، آلزایمر از NGFو پارکینسون از GDNFاستفاده شده است. بطور مثال طی تحقیق بر رویموش مدل پارکینسونی نشان داده شد که NTFsمانند GDNFآپوپتوز نورونی را کاهش و بقاء نورون­های دوپامینرژیکی را در شرایط آزمایشگاهی افزایش می­دهد] 116[.

1-6 سلول­های بنیادی عصبی

1-6-1 نوروسفر

سلول­های بنیادی عصبی(NSCs) به عنوان سلول­های تمایز نیافته تعریف می­شوند که قادر به خود تکثیری هستند و به سه رده سلولی تشکیل دهنده سیستم عصبی مرکزی، شامل نورون، آستروسیت و الیگودندروسیت تمایز پیدا می­کنند ( شکل.1-4) ] 140[.

جداسازی سلول­های بنیادی عصبی، نخستین بار توسطReynolds و Weissدر سال 1992 از CNSموش گزارش شد سپس در سال 1999 توسط Kukekovو همکارانش از CNSانسان استخراج شد] 141،142[.

شکل 1-4. سلول­های بنیادی عصبی و رده­های سلولی مربوط به آن. پر توان بودن یک سلول بنیادی عصبی منفرد با تولید سلول­های پروجنیتور، شامل سلول­های پروجنیتور عصبی neuronal progenitor cells (NP)و سلول­های پروجنیتورprogenitor cells (GP)glialنشان داده شده است.

در سیستم عصبی مرکزی در نواحی[68]SVZ واقع در دیواره جانبی بطن­های جانبی مغز قدامی، [69]SGZواقع در شکنج دندانه­ای[70]هیپوکمپ نورون­زایی به طور پیوسته در طول حیات رویمی­دهد] 143[.

رایج ترین روش کشت سلول­های بنیادی عصبی روش کشت سوسپانسیون است. در این روش سلول­های پیش­ساز عصبی به صورت ساختار کروی شکل به نام نوروسفر، تکثیر پیدا می­کنند. معمولا نوروسفر از سلول­های پروجنیتور یا سلول­های بنیادی عصبی سیستم عصبی مرکزی بالغ یا جنینی به صورت سوسپانسیون تک سلولی جدا می­شود] 144،145[.این سلول­ها را می­توان در محیطDMEM/F12]144،146[،DMEMوNeurobasal]49[، در حضور N2] 147،148 [یاB27 ]149،150 [درحضور EGFو FGF]146،149،151[کشت داد. حتی کشت این سلول­ها در محیط -MEMαو در حضور سرم نیز گزارش شده است ]152[.محققین از روش کشت NSCsبه صورت نوروسفر به عنوان روش مناسب برای نشان دادن ویژگی خود تکثیری و توانایی ایجاد رده­های متعدد عصبیاستفاده می­کنند (شکل 1-5)] 145 .[

شکل1-5. ارزیابی شکل­گیری نوروسفر. یکی از روش­های اصلی محققین برای شناخت بیولوژی سلول­های بنیادی در سیستم عصبی مرکزی، تکثیر این سلول­ها به صورت کلونی در کشت شناور و محیط حاویEGF و FGF2می­باشد که کشت نوروسفر نامیده می­شود. نوروسفری که از یک تک سلولی جدا می­شود قادر است به سه رده اصلی سلولی سیستم عصبی مرکزی مانند نورون، آستروسیت و الیگودندروسیت تمایز یابد.

این ساختار کروی هتروژن در بستری از ماتریکس خارج سلولی قرار گرفته­ و ساختار سه بعدی را تشکیل می­دهند که حاوی تعدادی سلول­های پیش­ساز عصبی و تمایز یافته و مقادیر قابل توجهی از βاینتگرین، گیرنده فاکتور رشد فیبروبلاستی و کادهرین­ها می­باشد]141[. در این ساختار سه بعدی، سلول­های مرکزی نوروسفر­ها تمایز یافته بوده وGFAP+ و tubulin+ βIII-هستند، ولی سلول­های بخش محیطی نوروسفر­ها، سلول­های تمایز نیافته بوده و Nestin+ EGFR+ و β+ اینتگرین می­باشند]153[.NSCs به دو شکل تک لایه[71]چسبنده و سوسپانسیون کشت داده می­شوند. ReynoldsوWeissواکثر گروه­های دیگر این سلول­ها را به صورت نوروسفر در سوسپانسیون کشت می­دهند]144،154[.

Zhengو همکارانش دو روش کشت NSCsبه صورت سوسپانسیون و تک لایه چسبنده را برای تکثیر طولانی مدت با هم مقایسه کرده و مشاهده کردند که NSCs در کشت به صورت سوسپانسیون مارکر نستین و در کشت به صورت تک لایه چسبنده، مارکر βIII- tubulin را به میزان بالایی بیان می­کنند. این نتایج نشان داد کهNSCsهاییکه به صورت سوسپانسیون کشت شدند تقسیم متقارن را نشان داده و دارای توانایی تکثیر بالایی هستند و موجب حفظ نسبت بالایی از سلول­های بنیادی می­شود. سلول­های پیش­ساز که از تقسیم سلولی نامتقارن خارج می­شوند در کشت چسبنده به سلول­های بیان کننده βIII- tubulinتمایز پیدا می­کنند.بنابراین کشت تک لایه چسبنده، تمایز نورونی راالقا می­کند و در کشت سوسپانسیون ویژگی بنیادی بودن خود را حفظ می­کنند] 155[.

یکی از روش­های کشت نوروسفر روش NSA[72] می­باشد که در سال 1992 آغاز شد، NSAبرای جداسازی سلول­های بنیادی عصبی از سیستم عصبی مرکزی و پرداختن به خصوصیات اساسی سلول­های بنیادی مانند خود تکثیری و توانایی تمایز به رده سلولی تمایز یافته و کارا می­باشد. تلاش محققین برای کشت و تکثیر سلول­های بنیادی مغز بالغ منجر به این شد که ReynoldsوWeissسیستم کشت فاقد سرم را برای کشت NSCsبه کار گیرند. بدنبال این روش کشت، سلول­های اولیه و تمایز یافته سیستم عصبی مرکزی باقی نمانده و از بین رفتند در حالیکه کشت فاقد سرم منجر به مرگ سلول­های بنیادی عصبی شد اما درصد کمی از این سلول­ها (1/0%) که به EGF پاسخگو بودند وارد فاز تکثیری شدند. بنابراین این محققین نشان دادند که یک سلول منفرد یا سلول پیش­ساز عصبی که از سیستم عصبی مرکزی بالغ جداسازی می­شود تکثیر شده و تشکیل مجموعه سلولی تمایز نیافته و کروی شکل را می­دهند که به این سلول­ها نام نوروسفر اطلاق می­شودکه متعاقبا، این نوروسفر­های اولیه به صورت تک سلولی برای تشکیل نوروسفر­های ثانویه جداسازی می­شوند یا نوروسفر­ها القا شده و به سه رده اصلی سلولی سیستم عصبی مرکزی تمایز می­یابند. این محققین در ادامه نشان دادند که سلول­هایی که با این روش

کشت جداسازی می­شوند ویژگی­های اصلی سلول­های بنیادی مانند تکثیرو توانایی تبدیل ب

نسل تمایز یافته و کارا را دارا هستند]143[.

کشت نوروسفر از سلول­های بنیادی جنینی نیز گزارش شده است. طی تحقیقاتKato و همکارانش در سال 2006، جسم مخطط جنین موش14-12.5 روزه نژاد6 / C57BLn در مدیوم نوروسفر در حضور EGFو FGF2 به مدت 7 روزکشت داده شد. اضافه کردن محیط کاندیشنال (شرطی) کشت نوروسفر­های اولیه[73] به ESCsتولید نوروسفر را در این سلول­ها القا می­کند بدون اینکه برای تمایز سلول­های ESنیاز به سلول­های پشتیبان[74] یا FCSباشد. فاکتورهای مترشحه از نوروسفر ­(NDF)[75] نقش مهمی در تولید نوروسفر از سلول­های ESدارد. این نوروسفر­ها وقتی در محیط تمایزی قرار می­گیرند در روز سوم از تمایز نشانگر­های نورونی TujوMAP2 و متعاقبا در روز هفتم مارکر GFAPو MPB [76]را بیان می­کنند. همچنین در شرایط in vivo قادر به تمایز هستند بدون اینکه تشکیل تومور دهند]156[.

NSCsبطور مستقیم از سیستم عصبی جنینی یا بالغ جداسازی می­شود اما به دلیل مشکلات

اخلاقی در استخراج NSCsازجنین یا فتوس و به علت ذخایر محدود سلول­های بنیادی درسیستم عصبی مرکزی و حتی محدودیت­هایی در استخراج NSCs از بافت مغز بالغ، سلول­های پیش­ساز عصبی که از سلول­های بنیادی مغز استخوان جداسازی می­شوند به دلایل متعددی به عنوان منبع مهمی در نظر گرفته می­شوند. این سلول­ها به راحتی از بیمار برداشت می­شوند، قابلیت و توانایی تکثیر بالا در in vitro دارند، دارای خاصیت تومورزایی محدود می­باشند و همچنین به صورت پیوند اتولوگوس در درمان بیماری­های نوروپاتولوژی استفاده می­شوند] 157،158.[

Kabos و همکارانش در سال 2002 تشکیل نوروسفر از سلول­های بنیادی مغز استخوان را درشرایط فاقد سرم (شرایط کشت مشابه با کشتNSCs)در کشت سوسپانسیون گزارش داد. با BMSCsاستفاده از این شرایط کشت قادرند به نورون تمایز پیدا کنند] 159[.

طی تحقیقی دیگر Wuو همکارانش در سال 2003، از هم کشتی MSCs با سلول­های پیش­ساز نورونی یا نوروسفر گزارش دادند، به این صورت که سلول­های بنیادی مزانشیمی بالغ به همراه سلول­های نوروسفری که از نخاع جنین جدا شده بودند به صورتتک لایه چسبنده کشت داده شدند.MSCsتاثیر بسیار زیادی بر سلول­های نوروسفرکه از کشت سلول­های نخاعیبدست آمده بودند داشته است. حضور تعداد کمی از سلول­های MSCs در سیستم هم کشتی تمایز سلول­های نوروسفر به هر دو رده سلولی نورون و گلیالی را القا می­کند. احتمالا فاکتور­های نوروتروفیک که از MSCsآزاد می­شوندتکثیر و تمایز سلول­های نوروسفر را حمایت می­کنند]160[.

Hermanو همکارانش ]161[ تولید توده­های سلولی کروی از سلول­های بنیادی مغز استخوان انسان با روشی مشابه به روش استخراج NSCsحاصل از سلول­های بنیادی جنینی گزارش داند] 162[. این سلول­ها از لحاظ فنوتیپی و مورفولوژیکی مشابه نوروسفر هستند و در حضور فاکتور­های رشد،قادرند سه فنوتیپ اصلی عصبی آستروگلیا، الیگودندروسیت و نورون را نشان دهند. این NSCsحاصل از مغز استخوان به صورت ساختار شبه نوروسفری با روش جداسازی و تکثیر سلول­های پیش­ساز عصبی کشت داده می­شوند]145،163[و قادر هستند میزان بالایی از نشانگر­های نورونی NeuroD1[77]، Neurog2[78]و MS11[79]به خوبی نستینبیان می­کنند]161[.

Neurog2و NeuroD1از ژن­های اولیه نورونی[80] هستند که برایشروع تکامل نورونی و تحریک تولید پیش­ساز­هایی که برای تمایز نورونی متعهد می­شوند ضروری هستند] 164[.

Suzuki و همکارانش در سال 2004، تولید نوروسفر از MSCsرا گزارش دادند. این محققین در مرحله القاء نورونی،MSCs را درحضور القاگرهای ­DMSO،hydroxyanisole butylated و

BMEکشت دادند، سلول­ها در این شرایط کشت مورفولوژی نورونی را نشان دادند و تعدادی از

این سلول­ها به صورت توده­های سلولی شناور از کف فلاسک جدا شدند. برای شکل­گیری نوروسفر، این توده­های­کروی­ به محیطNeurobasalA به همراه N2و bFGFمنتقل شدند بعد از 15-7 روز تشکیل نوروسفر دادند. این نوروسفر­ها سلول­های چند توانی هستند که در مدیوم تمایزی قابلیت تمایز به فنوتیپ عصبی شامل: نورون، آستروسیت و الیگودندروسیت را نشان دادند و با رنگ­آمیزی ایمنوسیتوشیمی به نشانگر­های نورونی Tuj-1وMAP-2،آستروسیتی GFAP والیگودندروسیتی O4پاسخ مثبت می­دهند]165.[

طی تحقیقی توسط Yangو همکارانش در سال 2008، تولید نوروسفر در محیط کشت F12 DMEM/به همراهEGF،bFGFوB27ازMSCs گزارش شده است.این نوروسفر­ها درمحیط

تمایزی به سلول­های عصبی و آستروسیتی تمایز پیدا کرده و نشانگر­های نورونیNSE، MAP-2

β-III tubulin و آستروسیتیGFAPرا بیان می­کنند] 166[.

علاوه بر این Xuو همکارانش در سال 2008 تولید نوروسفر را از سلول­های مزانشیمی بافت چربی در حضور EGFوbFGFگزارش دادند این نوروسفر­ها قادرند در محیط تمایزی سلول­های شوان حاوی RA، فورسکولین، PDGF-BB[81]و Heregulin به سلول­های شوان تمایز ­یابند و با رنگ­آمیزی ایمنوسیتوشیمی به نشانگر­ سلول­های شوان، مانندGFAPو S-100پاسخ مثبت می­دهند] 167[.

Tsengو همکارانش در سال 2006 تولید نوروسفر را از کشت طولانی مدت MSCsدر محیط IMDM[82]و سرم 10% گزارش دادند. به این صورت­که سلول­های MSCبه مدت شش هفته کشت داده شدند. بعد از کشت طولانی مدت، این سلول­ها به طور خودبخودی به نوروسفر تمایز یافته و از پیش­ساز­های نورونی نستین مثبت غنی می­شوند این پیش­ساز­های عصبی در شرایط مناسب کشت و با کاهش سرم و به همراه N2و فاکتور­ رشد bFGF به نورون تمایز پیدا می­کنند و نشانگر­های نورونی NF-H، β-III tubulinو تائو را بیان می­کنند] 168[.

Bez و همکارانش طی تحقیقی در بررسی فراساختاری نوروسفر نشان دادند که نوروسفر­ها دارای ساختار هتروژن هستند و نشانگر­های رده سلول­های عصبی را بیان می­کنند. مطالعات با میکروسکوپ الکترونی نشان داده که آپوپتوز و نکروز در قسمت مرکزی این ساختار به علت فقدان مواد غذایی بیشتر است. علاوه بر این، سلول­های بنیادی عصبی که از این نوروسفر­ها خارج می­شوند اندازه سلولی متفاوتی دارند و در فاز­های مختلف چرخه سلولی در کنار همدیگر زندگی می­کنند. وقتی یک نوروسفر روی ماتریکس کشت داده شود این سلول­ها ساختار کروی شکل خود را از دست داده و گسترش پیدا می­کنند و به صورت تک لایه در می­آیند. در لایه خارجی یکسری زوائد سیتوپلاسمی شبیه به پای کاذب از این سلول­ها جدا می­شود] 169[. طی بررسی­های فراساختاری نوروسفر، مشخص شده که آپوپتوز بیشتر در لایه­های داخلی بین لایه­های دوم وسوم رخ می­دهد. . نوروسفر­های بزرگتر دارای یک مرکز تیره هستند که معرف مناطق نکروتیک هستند که در اثر نکروز سلول­های درونی نوروسفر به دنبال فقر غذایی ایجاد می­شود ولی در بخش­های محیطی نوروسفر که به رنگ روشن است سلول­ها زنده هستند و از مواد غذایی اطرافشان استفاده می­کنند. سلول­های تشکیل دهنده نوروسفر هتروژن بوده و از نظر ساختار، گرانولاریتی، متابولیسم، محتویات سیتوپلاسمی و حتی چرخه سلولی با یکدیگر تفاوت دارند.وقوع پدیده­های بیولوژیکی مانند میتوز، پروسه نسخه برداری، آپوپتوز و نکروز وابسته به محل قرار گیری سلول­ها در ساختار نوروسفری می­باشد. معمولا در سلول­هایی که اطراف نوروسفر­ها را تشکیل می­دهند ( در محیط نوروسفر­ها قرار دارند) وقایعی مثل میتوز و سنتز پروتئینی رخ می­دهد یعنی سلول­هایی که در محیط نوروسفر­ها قرار دارند فعالیت سلولی بسیار بالایی دارند. زمانیکه سلول­های لایه خارجی­تر نوروسفر، 24ساعت با نشانگر Brduانکوبه شوند به طور فعالسنتز DNAرا نشان می­دهند. ولی در مرکز نوروسفر­ها وقایع آپوپتوز، فاگوسیتوز، نکروز و عدم وقوع میتوز و سنتز پروتئین­ رخ می­دهد. میزان زنده بودن سلول­های درونی نوروسفر وابسته به در دسترس بودن اکسیژن و مواد غذایی محیط کشت می­باشد. در واقع نوروسفر را می­توان یک ساختار قابل سازش با ریز محیط اطرافش دانست. اینکه نوروسفر­ها در شرایط کشت در اندازه­های کوچک و بزرگ هستند به علت حساسیت آن­ها به مواد موجود در محیط کشت­شان است نوروسفر­ها در حضور فاکتور رشد پاسخ متفاوتی می­دهند، به طوریکه دیده شده در کشت نوروسفر­های موش حضور EGFدر کشت باعث می­شود که ضخامت کلونی­های نوروسفری بزرگتر از زمانی باشد که فقط bFGF در محیط کشت حضور دارد و نوروسفرهایی که در شرایط کشت در معرض هر دو فاکتور EGFوbFGFقرار می­گیرند اندازه­های بزرگ و کوچک دارند]169[.

1-6-1-1 نوروسفر منبعی برای سلول درمانی

سلول­های بنیادی عصبی سلول­هایی با قابلیت خودتکثیری هستند که توانایی تمایز به انواع سلول­های عصبی را دارا می­باشند.در راستای ویژگی­های این سلول­ها در in vitro، همچنین توانایی درمانی­شان ­در in vivo، پیوند NSCs درمدل­ بیماری­های متعدد، مورد ارزیابی قرار گرفت. در این مطالعات به بررسی بقا، میزان پایداری، تمایز و کارا بودن این سلول­ها پرداخته شد] 170.[ برای مثال نوروسفرهاییکه از SVZجداسازی شده بودند به جسم مخطط بیماران مدل پارکینسونی پیوند زده شدند. این سلول­ها به آستروسیت و نورون­های TH+تمایز یافته و اختلالات حرکتی را بهبود بخشیدند] 171 .[نوروسفرهایی که از CNSجنین انسان جداسازی شده بودند به قشر مخ[83] موش­های صحرایی مدل ایسکمی پیوند زده شدند و مشاهده شد که این سلول­ها به آستروسیت و نورون تمایز می­یابند] 172[.طی تحقیقی همچنین NSCsانسان به جسم مخطط بیماران مدل هانتینگتونی پیوند زده شدند و این سلول­ها به آستروسیت و نورون متمایز شدند و حتی بهبود آناتومیکی و رفتاری مشاهده شد] 173[. موارد بیشتری که از نقش درمانی NSCsگزارش می­دهد شامل نوروسفرهایمهندسی شده است که می­توان از آن­ها به عنوان حامل مولکول­­های درمانی استفاده کرد که نوروپروتکشن را حمایت می­کنند.برای مثال NSCs که از کشت جسم مخطط جنین موش صحرایی بدست می­آید ( modify شده که GDNF را تولید می­کند) به مدل بیماری پارکینسونی پیوند زده شدند و به دنبال آن بقای نورون­های دوپامینرژیک مشاهده شد] 174[. در تحقیقی دیگر نوروسفر­های جدا شده از SVZموش بالغ را به صورت داخل عروقی به مدل­های بیماری مالتیپل اسکلروز مزمن (MS)[84] تزریق کردند که به دنبال آن سلول­های پیوندی به نواحی فاقد میلین مهاجرت کرده و به سلول­های بالغ عصبی مانند الیگودندروسیت­ها تمایز پیدا کردند. این نوروسفرهاتخریب سلول­های آستروگلیا و دمیلینه شدن را کاهش داده و ساخت دوباره میلین و بدست آوردن کارائی را تحریک می­کنند] 175[.

Takagi و همکارانش گزارش دادندکه نوروسفر­هایی که از سلول­های بنیادی جنینی میمون منشا می­گیرند قادرند تحت القاFGF-2 وFGF-20تعداد زیادی نورون­های دوپامینرژیک ایجاد کنند. با پیوند این نورون­ها به مدل پارکینسونی، بهبود رفتاری در آن­ها مشاهده شد]176[.

طی تحقیقی دیگر Luو همکارانش]177[گزارش دادندMSCهایی­که با نوروسفر­های استخراج شده از بافتمغز جنین هم­کشتی شوند برای پیوند و درمان در مدل بیماری TBI[85]مناسب هستند، این سلول­ها پس از پیوند زنده مانده و چهارده روز بعد از پیوند به دیواره­ی ناحیه تخریب شده، مهاجرت کردند. این نتایج پیشنهاد می­کند که سلول­های نوروسفر و استرومایی رشد یکدیگر را حمایت می­کنند. بدلیل اینکه بافت مغز جنین، بسیاری از پروتئین­های تکوینی مانند فاکتور­های رشد را بیان می­کند] 178[، بنابراین ریز محیط مناسب برای تکثیر، تمایز، مهاجرت و ارتباط نورون­ها را در طی تکوین مغز فراهم می­کند ]179[. سلول­های استرومایی یکسری از فاکتور­هایرشد را ترشح می­کنند که برای تکثیر و تمایز سلول­های استرومایی در کشت مورد نیاز هستند ]180[.

1-7 ضرورت اهداف تحقیق

سلول درمانی یکی از روش­های درمانی است که در سال­های اخیر تحقیقات گسترده­ای در خصوص آن­ انجام شده و محققین سعی بر آن داشتند که به کمک آن روش درمانی مناسبی برای ضایعات سیستم عصبی مرکزی پیدا کنند [181، 182].

سلول‌هاي بنيادي عصبي برخلاف ساير بافت‌ها، توانايي ترميم محدودي دارد. از طرفي با وجود سلول‌هاي بنيادي عصبي در داخل بافت مغز، ظرفيت توليد نورون‌هاي فعال جديد در پاسخ به ضايعات نيز محدود مي‌باشد [183]. بنابراين یکی از بهترين روش­های درمان، جايگزين كردن نورون‌هاي آسيب ديده با سلول‌هاي مناسب است [184،185].

سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي مغز استخوان بالغ، به‌عنوان مناسب­ترین سلول‌ بنيادي در جهت

سلول درماني شناخته شده‌اند. اين سلول‌ها به راحتي در دسترس بوده، خالص­كردنشان آسان است به گونه‌اي كه در شرايط كشت، به راحتي به كف فلاسك پلاستيكي مي‌چسبند،پاساژهاي مكرر باعث خالص شدن اين سلول‌ها درشرايط in vitro مي‌گردد [4،12،39]، كار باآن­ها هيچگونه موانع اخلاقي و قانوني به‌دنبال ندارد. با توجه به آنكه سلول‌هاي MSCازخودفرد گرفته شده و به خودش نيز پيوند زده مي‌شوند، بنابراين پس زدن پيوند را به همراه نخواهد داشت [4،14،186]. اين سلول‌ها ژن­هاي رده سلول‌هاي اكتودرمي، اندودرمي و مزودرمي را بيانمي‌كنند قدرت خود تكثيري و تمايز بالايي را در invitroدارند، به‌طوري كه قادرند در شرايط invivoو invitroبه سلول عصبي تمايز يابند [4،51،78،84،93].

به علت ذخایر محدود سلول­های بنیادی در سیستم عصبی مرکزی و عدم دسترس بودن این سلول­ها،سلول­هاي مزانشیمی مغز استخوان به عنوان منبع سلولی مهمی در استخراج سلول­های پیش­ساز عصبی­در نظر گرفته شده­ است. بسیاری از گزارشات اخیر مبنی بر تولید نوروسفر

در حضور فاکتور­های رشد از سلول­های بنیادی مغز استخوان می­باشد.

هدف ما در این پژوهش تولید نوروسفر از MSCsبدون حضور القاگر یا سایتوکین­در محیط بهکشت، بعد از کشت طولانی مدت (سه هفته) می­باشد، همچنین بررسی ظرفیت بیان فاکتور­های نوروتروفیک و بیان ژن­های اختصاصی سلول­های دوپامینرژیک (1Nurr وTH) و نشانگر سلول­های نورواپیتلیال (نستین) در این شرایط کشت توسط MSCs می­باشد. در این صورت بدون استفاده از عوامل القاگر می­توان با تولید خودبخودی سلول­های پیش­ساز عصبی و همچنین تمایز خودبخودی MSCsبهسلول­های شبه نورونی در این شرایط کشت، با حداقل دستکاری شرایط آزمایشگاهی راهرچهبیشتربهشرایطداخلبدننزدیککرد.

سوالاتی که در این پژوهش به آن پاسخ داده شد این است که:

آیا MSCsدر کشت طولانی مدت قادرند به سلول­های شبه نورونی تمایز پیدا کنند؟

آیا MSCsدر کشت طولانی مدت، فاکتور­های نوروتروفیک را بیان کنند؟

آیا MSCsدر کشت طولانی مدت قادرند بدون اضافه کردن القاگر به محیط کشت ژن­های نورونی را بیان کنند؟

آیا می­توان از MSCsکه به مدت سه هفته کشت داده شده­اند بدون حضور فاکتور رشدنوروسفرایجاد کرد

1 progenitor

2 Niche

3 symmetric

4asymmetric

1 Totipotent

2 Pluripotent

3Inner cell mass

4 Multipotent

5 adult Stem Cell

6 Embryonic Stem Cell

1 Hematopoietic stem cell

[12] Mesenchymal stem cell

3bone-forming progenitor cells

4 Colony forming unit fibroblasts

1 Multipotent adult progenitor cells

1 processed lipoaspirate

2 Adipose tissue –derived adult stem cell

3 In vitro

4 Stem Cell Factor

5 Stromal-derivedfactor-1

1 natural killercells

[21]majorhistocompatibility complex

1 Transforminn growth factor-β1

2 hepatocytegrowth factor

3 vascularendothelial growth factor

1Neural stem cell

1 Co-culture

2 Neuron- specific enolase

3 Neurofilament- M

4 Epidermal growth factor

5 Brain-derivedneurotrophic factor

6 Neuron-specific nulear protein

[32]Glial fibrillary acidic protein

[33]Microtubule-associated protein-2

1 Mesoncephalon

[35]Tyrosine hydroxylase

[36]Nerve growth factors

[37]Notch intracellular domain

[38] Ciliary neurotrophic factor

[39] Glial cell line- Derived Neurotrophic Factor

1 Adhesion molecules

1 Insulin growth factor

2 Central nervouse system

3 Middle cerebral artery occulotion

1 Neurotrophic Factors

2 Limb bud

[46]Peripheral nervouse system

[47] Basal forebrain

3 Substantia nigra

4 1-methyl-4-phenylpyridinium

5 Dorsal Root Ganglion

[51]Neurturin

[52]Artemin Dorsal Root Ganglion

[53]Persephin

[54] Amyotrophic lateral sclerosis

[55] Leukemia Inhibitory Factor

[56] Interleukin-6

1Tomore necrosis factor receptor

[58] Tomore necrosis factor receptor

[59] nuclear factor KB

1TNF receptor-associated factor-6

2 Neurotrophin receptor-interactingfactor

[62]Neurotrophin receptor p75 interactingMAGE homologue

4 receptor-interacting protein-2

1Signal transduction

2extracellular signal-regulated kinases

3mitogen-activated protein kinase

4 phosphoinositide 3-kinase

[68] Subventricular zone

[69] Subgranular zone

[70] dentate gyrus

 

1 monolayaer

2 Neurosphereassay

[73]conditioned medium of primary neurosphere culture

2 feeder

[75]Neurosphere-derived factor

[76]myelin basic protein

1 Neurogenic differentiation 1

2 Neurogenin 2

3 Musashi 1

4 Proneural genes

[81] platelet-derived growth factor

[82] Iscoves modified Dulbecco᾿s medium

[83] Cerebral cortex

[84]Multiple Sclorosis

[85] Traumatic brain injury


مبلغ واقعی 51,240 تومان    23% تخفیف    مبلغ قابل پرداخت 39,455 تومان

توجه: پس از خرید فایل، لینک دانلود بصورت خودکار در اختیار شما قرار می گیرد و همچنین لینک دانلود به ایمیل شما ارسال می شود. درصورت وجود مشکل می توانید از بخش تماس با ما ی همین فروشگاه اطلاع رسانی نمایید.

Captcha
پشتیبانی خرید

برای مشاهده ضمانت خرید روی آن کلیک نمایید

  انتشار : ۱۶ آذر ۱۳۹۶               تعداد بازدید : 1304

برچسب های مهم

کسب درآمد اینترنتی 300000 تومان در خانه در کمتر از 30

کسب درآمد اینترنتی 300000 تومان در خانه در کمتر از 30

این محصول آپدیت شد تاریخ 1397/05/26 اضافه شدن ویدیوی جدید بسم الله الرحمن الرحیم کسب درآمد اینترنتی سلام در دنیای اینترنت خیلی از آدم ها هستند که دوست دارند کسب درآمد کنند و به خیلی چیزها و ایده ها فکر میکنند . همه ما دوست داریم در کمترین زمان بهترین درآمد را داشته باشیم ...

کسب درامداز اینترنت ماهیانه 8میلیون تومان

کسب درامداز اینترنت ماهیانه 8میلیون تومان

پکیج کسب درآمداسان از اینترنت اپدیت جدید 15 اردیبهشت 1397 مناسب برای تمامی افرادباهرسن ودانشی این فرصت هرگز تکرار نمیشود عجله کنید تضمین100%بازگشت وجه درصورت عدم کسب این مبلغ هدیه ویژه پس از خرید این محصول: 1.نرم افزار کی به وای فای وصله نرم افزاری برای ...

اد ممبر بینهایت ( افزایش ممبر(اعضای) کانال،ربات و

اد ممبر بینهایت ( افزایش ممبر(اعضای) کانال،ربات و

-اد ممبر بینهایت- {افزایش ممبر(اعضای) کانال،ربات و گروه تلگرام و...} Addmember نسخه ویژه(VIP) تمامی و کامل ترین نرم افزار های افزایش ممبر واقعی و فیک و آموزش های آن، که در اینترنت و بازار به قیمت های بالا به فروش می رسد را یک جا و مرتب و منظم به همراه راهنما در هر بخش، با قیمتی کم در ...

افزایش قد با متد گرو تالر داینامیک

افزایش قد با متد گرو تالر داینامیک

بلند قامت بودن یک امتیاز بزرگ برای شماست! سلام بیتا بیات هستم کارشناس فیزیولوژی ورزشی،لازم دانستم قبل از این که شما با روش گرو تالر داینامیک آشنا شوید چند تا نکته رو صادقانه خدمتتان عرض کنم همانطور که تو اینستاگرام(khosh.andam@)نوشتم خیلی اتفاقی با این متد آشنا ...

نرم افزار برنامه ساز اندروید نسخه طلایی

نرم افزار برنامه ساز اندروید نسخه طلایی

نرم افزار برنامه ساز اندروید نسخه طلایی و بدون نیاز به ارتقا توجه :مشکل امضا با کلید دیباگ دراین نسخه کاملا رفع شده و برنامه ها به بازار ارسال می شوند اگر به این مشکل برخوردید ما 10برابر پولتان را پس میدهیم. این نرم افزار بر روی اندروید قابل نصب میباشد 100% مورد تایید ...

نسخه خطی اشعار و پیشگویی های شاه نعمت الله ولی

نسخه خطی اشعار و پیشگویی های شاه نعمت الله ولی

شاه نعمت‌الله ولی نسخه خطی اشعار و پیشگویی های شاه نعمت الله ولی پر فروشترین کتاب نسخه خطی با بیش از 2000000 فروش تا کنون جهت سفارش بر روی لینک زیر کلیک نمائید . ...

مجموعه ی آموزش تعمیر لامپ کم مصرف (از مبتدی تا

مجموعه ی آموزش تعمیر لامپ کم مصرف (از مبتدی تا

کتاب آموزش تعمیر لامپ کم مصرف همانطور كه مي دانيد لامپ هاي كم مصرف بعد از مدتي ديگر روشن نمي شوند و نياز به تعمير دارند در بيشتر اين موارد مي توان با ساده ترين وسايل لامپ را در منزل تعمير كرد این مجموعه دارای 5 کتاب است که در آن نحوه عملکرد و روش های عیب یابی لامپ کم ...

کسب درآمد 300هزار تومان در 60دقیقه

کسب درآمد 300هزار تومان در 60دقیقه

کسب درآمد 300/000تومان در 60 دقیقه آپدیت مهرماه 97 نکته: دوستان عزیز یکی از سوالاتی که خیلی از کاربران میپرسند اینه که آیا پکیج شما همون پکیجی هستش که تو اینترنت زده (کسب درآمد ۳۰۰ هزار در 30 دقیقه ) ؟! نخیر ، اون (پکیج کسب درآمد ۳۰۰،۰۰۰ در ۳۰ دقیقه ) به شما باینری آپشن و فارکس ...

تمامی نرم افزار های اددممبر واقعی و فیک

تمامی نرم افزار های اددممبر واقعی و فیک

تمامی و کامل ترین نرم افزار های افزایش ممبر واقعی وفیک را یک جادریافت کنیدهرکدام از این نرم افزار ها در اینترنت و کافه بازاربه قیمت خیلی بالایی بفروش میرسند. نکته: پورسانت بازاریابی این محصول 60% است نسخه ی 100%تست شده با توجه به فیلترینگ تلگرام 15 اردیبهشت ...

آموزش افزایش سایز آلت تناسلی بدون دارو و دستگاه

آموزش افزایش سایز آلت تناسلی بدون دارو و دستگاه

اگر واقعا می خواهید با مشکلات جنسیتان به کلی خدا حافظی کنید لطفا مطالب زیر را با دقت بخوانید...! در اين سايت روشي را به شما معرفي مي كنيم براي بزرگ كردن آلت تناسلي كه نتايج فوق العاده اي براي شما در بر خواهد داشت،كه خودتان هم باور نمي كنيد: . . . 1-افزايش طول و ضخامت به ...

کتاب افزایش ممبر کانال تلگرام

کتاب افزایش ممبر کانال تلگرام

افزایش اعضای کانال تلگرام ، مهمترین دغدغه صاحبان کانال در این شبکه اجتماعی موبایلی است.در این مطلب موثرترین روش های افزایش اعضای کانال تلگرام را به شما آموزش خواهیم داد. در ابتدا ذکر این نکته لازم به نظر می رسد که افزایش اعضای کانال تلگرام ( Telegram ) با روش های غیر معمول ...

مجموعه -صفر تا صد راه اندازی کارگاه جوراب

نام محصول: مجموعه صفرتاصد راه اندازی کارگاه جوراب بافی تهیه کننده: دوران راهبی انتشار: وبسایت بچه‌های نساجی دانشگاه یزد فرمت محصول: کتاب الکترونیکی(PDF) + ویدئو MP4 قابل پخش در: موبایل، تبلت، کامپیوتر و ... مخاطب این بسته آموزشی: تمام افراد مبتدی که حداقل سرمایه ...

دانلود کتاب آموزش ساخت انواع کابینت مدرن MDF

دانلود کتاب آموزش ساخت انواع کابینت مدرن MDF

نوع فایل:PDF زبان:فارسی حجم فایل:18KB در چند دهه اخیر با توجه به افزایش رشد آپارتمان سازی ، تعداد متقاضیان ساخت کابینت نیز افزایش پیدا کرد و با توجه به تغییر ماهیت کابینت ها از فلزی به MDF و تمایل به تغییر مکرر دکوراسیون آشپزخانه از سوی خانواده ها ، کابینت سازی نیز در میان مشاغل ...

دانلود کتاب آموزش خوشنویسی با قلم و خودکار همراه

دانلود کتاب آموزش خوشنویسی با قلم و خودکار همراه

محتوای این مجموعه کامل آموزش خوشنویسی: 1- آموزش خوشنویسی با خودکار 2-سرمشق های خوشنویسی 3- آموزش خط تحریری 4-آداب خوش نویسی فايده اول خوشنويسی: كه روحي و دروني است ٬رويت خط زيبا موجب بهجت روحي و حظ معنوي مي شود و البته بهره معنوي خوشنويس مضاعف و مبتدا است و آثار و بركاتي ...

کسب درآمد 650میلیون تومانی در یک روز کاملا تست

کسب درآمد 650میلیون تومانی در یک روز کاملا تست

این روزها با توجه به شرایط نامناسب اقتصادی کشور، کسب درآمد برای خیلی از افراد جامعه بسیار دشوار است. بسیاری از افراد به امید اینکه در آینده بتوانند یک شغل کارمندی داشته باشند به سختی درس می خوانند و عده ای دیگر که نتوانند درس بخوانند نیز راه های دیگری را انتخاب می کنند. ...

دانلود پکیج درآمدزایی 400هزارتومن ناچیز در 40دقیقه

دانلود پکیج درآمدزایی 400هزارتومن ناچیز در 40دقیقه

برای درآمدزایی فوق العاده، فقط توضیحات زیر را تا انتها بخوانید. ما درآمد شما را تضمین می کنیم. واقعا ده میلیون تومن درآمد ماهیانه هیچ چیز خاصی نیست. اینقد واسه خودتون بزرگ و دست نیافتنیش نکنین دوستان من، اگه به ضمیرناخودآگاه خودتون القا کردین که اون بزرگه و شما ...

آموزش برنامه نویسی آردوینو

آموزش برنامه نویسی آردوینو

معرفی آردوینو : آردوینو یکی از معروف ترین platform های متن باز است که روی برد های خود از میکروکنترلر های AVR و ARM شرکت atmel استفاده کرده است . هدف اردوینو استفاده از مدار چاپی واحد بود که توانست باعث شود توزیع دهنگان این platform باهم به اشتراک گذاری کد ها و شماتیک پروژه ی ...

چگونه هر شخصی را عاشق خود کنیم ارزان

چگونه هر شخصی را عاشق خود کنیم ارزان

کتاب چگونه هر شخصی را عاشق خود کنیم ارزان کتاب چگونه هر شخصی را عاشق خود کنیم ارزان خیلی از وقت ها دوست داشته اید شخص و یا همسر خود را عشق خود نمایید. عاشق شدن به تمام معنا، طوری که هیچ کسی را به اندازه شما دوست نداشته باشد شما را کامل قبول ...

تماس و پیامک ناشناس و رایگان با شماره

تماس و پیامک ناشناس و رایگان با شماره

برنامه تماس و ارسال پیام رایگان به دیگران با شماره ناشناس به صورت کاملا رایگان بدون نیاز به روت به وسیله این برنامه میتوانید با شماره دلخواه خود به دیگران زنگ بزنید. یعنی زمانی که شما با دیگران تماس می گیرید شماره دلخواهی که شما در برنامه وارد کرده اید برای شخصی که ...

چگونه هر کسی را عاشق خود کنیم ؟

چگونه هر کسی را عاشق خود کنیم ؟

چگونه هر کسی را عاشق خود کنیم ؟ خیلی از وقت ها دوست داشته اید شخص و یا همسر خود را عشق خود نمایید. عاشق شدن به تمام معنا، طوری که هیچ کسی را به اندازه شما دوست نداشته باشد شما را کامل قبول داشته باشد و یا می خواهید دل کسی را بدست بیاورید و در این راه همیشه با شکست مواجه شده ...

دانلود رایگان کتاب رستاخیز مردگان العضیف pdf نسخه

دانلود رایگان کتاب رستاخیز مردگان العضیف pdf نسخه

معرفی کتاب:رستاخیز مردگان العضیف ترجمه شده نسخه فارسی عربی وانگلیسی (رستاخیز مردگان العضیف)کتاب نکرونومیکون ( آخرت مردگان ) و یا کتاب دیوانه کننده القابی است که روی این کتاب نهاده اند.!! نام دیگرش ولی الضعیف است..!! مؤلف اصلی این کتاب فردی بدوی اهل شام به نام عبدل ال حضرت در سال ...

کسب و کار اینترنتی در منزل

کسب و کار اینترنتی در منزل

کسب درآمد میلیونی اینترنتی و تضمینی در منزل جدید ترین و مطمئن ترین روش کسب درآمد در سال 1394 تعهد و ضمانت ما : در عرض فقط یک ساعت اول کسب درآمد نمایید بعد از درآمد آن این مجموعه را خریداری نمایید می دانیم همه ما از مطالب تبلیغاتی و الکی که در مورد کسب و کار اینترنتی است خسته ...

اینترنت رایگان همراه اول و ایرانسل !!!!!

اینترنت رایگان همراه اول و ایرانسل !!!!!

توجه توجه روش هایی که کاملا قانونی هستند اما جایی آن ها را پیدا نمیکیند این روش ها بسیار ساده و کاربردی هستند و تنها با طی مراحلی ساده شما می توانید در کم تر از دو دقیقه حداقل ۱ گیگ اینترنت رایگان همراه اول و ۱۴ گیگ اینترنت رایگان ایرانسل دریافت کنید. بعضی وقت ها پیش ...

آموزش رایگان کسب درآمد از سایت الیمپ

آموزش رایگان کسب درآمد از سایت الیمپ

خیلی از دوستان سوال پرسیدن در مورد نحوه ثبت نام که ما در ویدیو زیر تمام موارد را آموزش دادیم در ویدیو زیر در مورد نحوه ثبت نام در سایت الیمپ و آشنایی با تمام اجزای مهم سایت الیمپ توضیح دادیم . برای رفتن به سایت الیمپ کلیک کنید برای شناخت کار با اندیکاتور ...

ردیاب شماره موبایل افراد رو نقشه بدن نیاز به Gps

ردیاب شماره موبایل افراد رو نقشه بدن نیاز به Gps

- ردیاب شماره موبایل افراد رو نقشه بدن نیاز به Gps ردیابی و کنترل از از راه دور ، با وارد کردن شماره موبایل نرم افزار ردیاب شماره موبایل کاملا ایرانی و فارسی بدون نیاز به فعال بودن GPS گوشی شما و طرف مقابل با استفاده از این نرم افزار ردیاب شماره موبایل فرزندان و افراد ...

اپلیکیشن سامانه مخابرات همراه

اپلیکیشن سامانه مخابرات همراه

اپلیکیشن فوق العاده و کم یاب سامانه مخابرات با امکانات زیر که گویای محتواست قابلیت استعلام شماره موبایل قابلیت کشف مزاحم تلفنی قابلیت دریافت ریز مکالمات مشترکین تلفن همراه مشترکین حقوقی مشترکین تلفن ثابت پیش شماره ها ...

مجموعه -صفر تا صد راه اندازی کارگاه جوراب

مجموعه -صفر تا صد راه اندازی کارگاه جوراب

نام محصول: مجموعه صفرتاصد راه اندازی کارگاه جوراب بافی تهیه کننده: دوران راهبی انتشار: وبسایت بچه‌های نساجی دانشگاه یزد فرمت محصول: کتاب الکترونیکی(PDF) + ویدئو MP4 قابل پخش در: موبایل، تبلت، کامپیوتر و ... مخاطب این بسته آموزشی: تمام افراد مبتدی که حداقل سرمایه 5 میلیونی ...

آموزش کسب درآمد از اینترنت

آموزش کسب درآمد از اینترنت

آیا می دانید؟ یک راز مهم در مورد سایت های کسب درآمد از اینترنت که ممکن است ندانید. می دانید چرا سایت های مختلفی که دیده اید نتوانسته اند به شما کمک کنند کسب درآمد کنید؟حقیقت این است که اکثر این سایت های آموزشی برای کسب درآمد در اینترنت توسط ...

سوال عملی ICDL 2 همراه با جواب - ( سری اول )

سوال عملی ICDL 2 همراه با جواب - ( سری اول )

سوالات عملی ICDL2 همراه با جواب (ویندوز - اینترنت و ایمیل ) تعداد فایل : 7 نوع فایل : Pdf ...

سوال عملی Power Point با جواب

سوال عملی Power Point با جواب

دانلود نمونه سوال قطعی پاورپوینت با جواب تشریحی تعداد فایل : 2 نوع فایل : Pdf ...


مطالب تصادفی

  • استفاده از نشاسته اصلاح شده هیدروکسی پروپیل دی استارچ فسفات به عنوان جایگزین روغن در سس مایونز  ....
  • استفاده از عصاره برگ زیتون به جای آنتی اکسیدان ها و نگهدارنده های سنتزی در سس مایونز و ارزیابی تغییرات فیزیکوشیمیایی .....
  • استخراج لیکوپن از ضایعات گوجه فرنگی.....
  • استخراج پلی ساکارید از برگ گیاه هفت کول و بررسی فعالیت ضد اکسایشی و ضد میکروبی آن....
  • استخراج پروتئین از کنجاله آفتابگردان و بررسی ویژگی‌های عملکردی آن....

بندرعباس

فروشگاه فایل های دیجیتالی کمیاب